一.  Total RNA的提取 
二.  mRNA的分离 
三．cDNA双链合成 
四．载体制备 
五.  cDNA双链和载体的连接 
六．电转化流程 
七．快速鉴定、菌落PCR 
八．pBlueScript cDNA库扩增

一.Total RNA的提取

(一)试剂配制
准备工作：
1.研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2.50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。
3.电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4.常用试剂及其配方：
▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5
                                   三水合柠檬酸纳    22.94g
                                   加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。        
▲10%肌氨酸钠：
                              肌氨酸钠           10g
                               加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。               
▲变性裂解液：                  
                            0.78M柠檬酸钠    8.25ml
                            10%肌氨酸钠      12.375ml
                             异硫氰酸胍        118.05g
                             加DEPC水定容至  250ml，室温放置备用
                             临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）
▲ 2M 醋酸钠     PH=4.5 
                             NaAc·3H₂O        13.6g
                             加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲3M醋酸钠      PH=5
                            NaAc·3H₂O        20.4g
                            加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲    4M LiCL:
                             LiCL               24.164g
                            加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用
▲0.5M EDTA   PH=8.0 
                             EDTA              18.61g
                            用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用                 
▲10X  MOPS  (3-（N-吗啉代）丙磺酸):
                           MOPS              41.86g
                           NaAC·3H₂O        4.10g
                           0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml
                          用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
▲1x  MOPS:
                         10x  MOPS         30ml
                          加DEPC水270ml，用时现配。
▲4x RNA  Loading  buffer:
                  10x MOPS                 400ul
                  甘油（高压过）            200UL
                  溴酚兰                    10ul
                  甲醛(37%)                 72ul
                  去离子甲酰氨             310ul
                  EDTA(0.5M  PH 8.0)        8ul
                  ErBr(10mg/ml in DEPCH₂O)   70ul 
                  在4℃ 可保持3个月
▲10x PBS
                    pH=7.4
                     NaCl    80g  
                     KCl     2g 
                     Na₂HPO₄   14.4g
                     KH₂PO₄    2.4g
                     定容至     1000ml

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