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临床样品基因组DNA小量抽提标准操作规程(SOP)
作者:未知 来源:生物秀 时间:2007-7-12

    8.福尔马林处理的样品:
    ① 将25~30mg福尔马林处理样品用手术刀切成小块,转入离心管(用户自备)中。
    ② 加入2ml PBS(或生理盐水),室温浸泡30分钟。
    ③ 5,000 转/分,室温离心10分钟。
    ④ 小心移走上清,重复步骤②-③一次。
    ⑤ 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。

    注意:
    ① 如果样品的体积不足200μl,加入TE补足到200μl。
    ② 如果样品不能马上用于抽提基因组DNA,可于-20℃保存备用。
    ③ 样品不能反复冻融,否则基因组DNA的完整性(长度)和产率都会受到影响。
    ④ 样品不要太多,否则基因组DNA的纯度和产率反而下降。

    操作步骤:
    1.在按样品准备方法制备的200μl样品中,加入400μl DCL Buffer,混匀; 加入3μl Proteinase K,混匀,55℃保温5~10分钟。
    注意:① 应按次序加入,不得将Proteinase K先混入DCL Buffer,再加到样品中。② 保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品,55℃保温5分钟足以使细胞裂解,释放出基因组DNA。而对于组织类样品,55℃保温则视降解效果而定。降解完全的样品应是透明不粘稠的液体。组织类样品一般在1-3小时内作用完全。过夜处理通常不影响产率。

    2.加入260μl 无水乙醇,混匀,然后用1-ml Tip头将样品全部转移到UNIQ-10柱,柱子放入2.0-ml Collection Tube。

    3.用台式离心机,10,000转/分,室温离心1分钟。

    4. 取下UNIQ-10柱,弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中,加入500μl Wash Solution,10,000转/分,室温离心1分钟。

    5.重复步骤4一次。

    6.取下UNIQ-10柱,弃去Collection Tube中的全部废液。将柱子放回同一根Collection Tube中,10,000转/分,室温离心1分钟,以除去残留的Wash Solution。

    7.将柱子放入新的无菌的1.5 ml离心管中,在柱子中央加入50μl Elution Buffer,室温放置2分钟。

    8.10,000转/分,室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。根据用途,样品可于4℃或-20℃保存。
    注意:① 为提高洗脱效率,可以将柱子在37-55℃保温2分钟。② 如果样品中基因组DNA含量很低,用30μl Elution Buffer洗脱可以提高洗脱液的样品浓度。但是,产率有所下降。③ 重复步骤7-8,可以提高产率20%。

    9.用分光光度计按1OD260=50µg测量基因组DNA含量,并通过0.7%琼脂糖电泳凝胶判定DNA的完整性,也可以判定样品中是否有RNA。该试剂盒抽提出来的DNA长度可在50kb以上。

    注意:
    ① 血液样品中的DNA产量取决于血细胞的数量。
    ② 从琼脂糖凝胶仅能观察到白细胞基因组DNA,血清中病毒DNA因含量太少,不能用琼脂糖凝胶直接观察。③ 通常50μl PCR反应体系中用1-5μl DNA抽提液。
    主要参考文献:参阅Sangon提供的试剂盒操作手册。

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