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临床样品基因组DNA小量抽提标准操作规程(SOP)
作者:未知 来源:生物秀 时间:2007-7-12

    目的:
    1. 从人或动物血液中抽提基因组DNA。
    2. 从体液,唾液,尿液中抽提基因组DNA。
    3. 从人体组织,切片和各种临床样品中抽提基因组DNA。
    4. 抽提出的DNA可以用于PCR及相关诊断。

    原理:
    临床常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA,用于病症的辅助性分析和诊断。样品根据试剂盒(SK1341试剂盒,上海生工)提供的方法进行处理,然后在特定的DCL Buffer中用Protenase K和去污剂裂解。用UNIQ-10柱吸附样品中基因组DNA。UNIQ-10能选择性吸附DNA,而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。经简单的洗涤步骤,样品基因组DNA可用Elution Buffer回收。抽提出的DNA可以用于PCR及相关诊断。

    样品准备:

    1.血液:
    ① 血液收集:血液必须用ACD(0.48% Citric Acid,1.32% Sodium Citrate,1.47% Glucose)抗凝。6ml血液用1ml ACD抗凝。因为从用肝素抗凝血液中抽提的DNA常有PCR抑制剂存在,不能用于PCR反应。血液4℃可以存放2周左右,-20℃可以放置1~2月。
    ② 由于红细胞和血小板不含细胞核,血液中的基因组DNA主要来源于白细胞和血液中的病毒等。通常从200µl血液中可获约2~4µg DNA。如果需要较大量的DNA,可以用500µl血液。处理方法如下:500µl血液中加入1ml无菌水,5,000转/分,离心2分钟去上清。用200µl TE将白细胞悬浮起来备用。
    ③ 新鲜血样品如不能立即用于抽提DNA,可置于4℃,但不要超过2个星期。欲长期储存,请分装成200µl/管,储存于-20℃。


    3. 生物组织:
    ① 5~30mg组织样品用手术刀切成小块,在液氮中碾碎。
    ② 将粉末收集到1.5-ml离心管中,用200µl TE悬浮。

    4.石蜡生物组织:
    ① 25~30mg石蜡生物组织样品用手术刀切成小块,转入2-ml离心管(用户自备)中。
    ② 加入1.2ml二甲苯溶剂(用户自备)。用振荡器振荡。(目的是除去石蜡)
    ③ 用台式高速离心机,12,000转/分,室温离心5分钟。
    ④ 小心移走上清,注意不要移走沉淀物质。
    ⑤ 加入1.2ml无水乙醇,小心用振荡器振荡,室温放置1分钟。
    ⑥ 室温,12,000转/分,离心5分钟。
    ⑦ 重复步骤④~⑥一次以除去残留的二甲苯溶剂。
    ⑧ 打开离心管盖,小心弃上清,37℃保温10~15分钟以除去残留的乙醇。
    ⑨ 样品用200μl TE 悬浮。

    5.生物体液:
    ① 将体液转移到离心管中,根据体液的性质,确定体液的用量。如果体液的体积小于200μl,可以直接使用。
    ② 5,000 转/分,室温离心10分钟。
    ③ 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。

    6.尿液:
    ① 将尿液转移到离心管中,5,000 转/分,室温离心10分钟。
    ② 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。

    7.眼、鼻、喉等拭样(Swabs)
    ① 将拭样(Swabs)转移到离心管中,加入2ml PBS(或生理盐水,用户自备),室温浸泡2~5小时。
    ② 5,000转/分,室温离心10分钟。
    ③ 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。

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