病毒分离
分离病毒是诊断病毒性疾病最常用，并且高度敏感的方法之一。分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。病毒可长期保存，亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。病毒分离亦受一定限制。目前用于分离病毒的组织细胞种类有限，每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。MDCK（狗肾细胞）是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚，目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程

材料：1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞
2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源XIII型）Sigma Cat. # T-8642
3、HEPES 缓冲液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-023
4、D-MEM培养基，GIBCO BRL Cat. # 11965-092
5、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 µg/ml 硫酸链霉素) ，GIBCO BRL Cat. # 15140-023
6、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-011
7、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品
8、T-25培养瓶用于病毒培养，（组织培养管也可被应用，若样本量大的话应选用培养瓶，细胞数量按规定调整。）
9、1ml 滴管
10、10ml 滴管
培养基和试剂的准备：（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）
500 ml D-MEM液中加入：
青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 µg/ml 链霉素)
牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)
HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)
病毒生长液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/ml ）使TPCK-胰酶的浓度为2 µg/ml。
方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物安全Ⅱ实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全Ⅱ实验室要求着必要的个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）

程序：
Ⅰ 细胞培养瓶的准备
1、显微镜检查细胞生长状态，40倍放大。
2、用病毒培养液替代细胞生长液，保证使用合适的病毒培养基。
3、轻轻倒出细胞生长液于广口瓶中，用6 ml of含2 µg/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗细胞3遍。
Ⅱ 细胞培养瓶的接种
1、用无菌的移液管将D-MEM从细胞培养瓶中移出。
2、用无菌的移液管吸取200 µl临床样品置于细胞培养瓶中。
3、接种物37℃吸附30分钟。
4、加6 ml of含2 µg/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的完全D-MEM液于细胞培养瓶中。
5、每细胞培养物的收获日检测细胞病变。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大。细胞核固缩或破裂。严重时细胞部分或全部脱落）
Ⅲ 细胞培养物的收获
1、当细胞病变为3+或4+时，收获细胞悬液并加稳定剂如：甘油或终浓度为0.5%的牛血清白蛋白。即使无细胞病变也应该于6-7天收获。
2、进行红细胞凝集实验并4℃保存。如没有红细胞凝集现象在报告不能从样品中分离病毒前，应再传代2-3次。
3、如果有必要，应3000转离心5分钟以去除剩余的细胞。通过血凝抑制实验鉴定分离物，并在收获的一天间将分离物保存在-70℃条件。

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