对所用菌株进行鉴定
1.组氨酸营养缺陷(his-)鉴定。取两块底层葡萄糖琼脂平板,其中一块加入0.1mol/L L 一组氨酸0.1mol和0.5mmol/L生物素0.1ml,另一块(对照)只加入生物素。用白金耳先在生物素对照平板上划线,然后再在组氨酸/生物素平板上划线,四种菌株可划在同一平板上。在培养皿底部用标记笔注明每一菌株划痕。翻转平板,37℃培养24~48小时,观察细菌生长情况。对照平板无细菌生长,含组氨酸平板应有细菌生长。
2.深粗糙突变(rfa)鉴定—结晶紫抑菌试验 加0.1ml等测菌液于装有2ml上层培养基(融化后保持在45℃)的试管中,旋摇混匀后倾倒于营养琼脂平板上,倾斜旋转平板使之分布均匀。凝固后,将一灭菌滤纸片放在平板上,于纸片中心滴加1mg/ml结晶紫10μl,或先用灭菌滤纸片沾取结晶紫液,再放置平板上。倒置平板,在37℃培养12~24小时如在纸片周围出现明显的抑菌带(约10mm),则表明有rfa突变存在。
3.uvrB鉴定——紫外线敏感试验 用灭菌拭子拈取测试菌株在营琼脂平板上做平行划线。有R因子的菌株(TA97,TA98,TA100等)划线在另外的平板上。用黑纸遮住无盖平板的一半,另一半在距离33cm处,用一个15W紫外线灯照射,有R因子菌株照射8秒钟。在同一平板上,应用时用切除修复功能的菌株(如TA102)作为对照。平板照射后,在37℃培养1~24小时,具有uvrB缺陷的菌株,只在未经照射的一侧平板上生长。
4.R因子(pKM101质粒)鉴定—抗氨苄青霉素试验 用10μl左右氨苄青霉素(8mg/ml,0.02mol/L NaOH)在营养琼脂平板上划线,同时用等测菌液在同一平板上与氨苄青霉素交叉划线。在同一平板上可鉴定几种菌株,其中包括一种没有R因子的对照菌株(如野生型),用以说明氨苄青霉素的效力。在37℃培养12~24小时,无R因子者在两线交叉处出现抑菌,有R因子者则无抑菌现象。亦可仿照鉴定rfa突变的方法,用浸有氨苄青霉素的滤纸片贴在已接种R因子待测菌株的平板上。若纸片周围无抑菌圈,则表明对氨苄青霉素有抗性,即R因子存在。
5.pAQ1质粒鉴定——抗四环素试验 方法类似R因子鉴定,四环素浓度为8mg/ml,0.02mol/L HCl,用量10μl。
6.自发回变鉴定 加0.1ml待测菌液于含有2ml上层培养基的试管中,混匀后铺倒在底层基本培养基上。37℃培养24小时,计数每皿自发的回变菌落数。
四种标准菌株的回变菌落数(不加S9)
营养肉汤配制(增药用),氯化钠0.5g、牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、双蒸水100ml,溶解后,用4N NaOH调pH至7.2 ,15磅灭菌20分钟,备用。


