细胞冷冻保存
1.注意事项：
1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4.冷冻保存之细胞浓度：
1.4.1.normal human fibroblast:1~3×106 cells/ml
1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
1.4.3.adherent tumor lines:5~7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3×106cells/ml。
1.4.4.other suspensions:5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
1.5.冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。
1.6.冷冻方法：
1.6.1.传统方法:4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16-18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
1.6.2.程序降温：利用等速降温机以–1～-3oC/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
2.材料：
2.1.生长良好之培养细胞
2.2.新鲜培养基
2.3.DMSO(SigmaD-2650)
2.4.无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)
2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)
2.6.血球计数盘与盖玻片
2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)
3.步骤：
3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
3.5.冷冻保存方法1:冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。
3.6.冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为:program7:HBCELL
细胞培养-冷冻细胞活化
1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3.材料
3.137℃恒温水槽
3.2新鲜培养基
3.3无菌吸管/离心管/培养瓶
3.4液氮或干冰容器
4.步骤：
4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
4.3将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
4.4取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
4.5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
4.7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
