（二）培养细胞的保存和复苏
做实验前要先学会冻存，以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞，且可减少污染或其它不利影响。
1.影响冻存细胞活性的因素
（1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。
（2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。
（3）保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。
（4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃～43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。
2.冻存与复苏方法
适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）。A.细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2～5×106/ml。B.分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。D.为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃～43℃水浴中，充分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。E.细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用的生长液，置37℃培养。
四．基本设备和试剂
设备（略），环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。
基本试剂
培养液：①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，过滤除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分钟灭活（破坏补体）分装置-20℃保存备用。③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解，分装冻存于-20℃，使用前融化，每100ml生长液中加1ml，即使用终浓度为含P.S100μg/ml。（注：P.S不能冻融多次，应少量分装，一次用完）。④NaHCO3液，用于调整pH值，常用浓度为5～6%，配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌，分装4℃保存。⑤胰蛋白酶在pH8.0，温度37℃时作用力最强（详见配方）。⑥EDTA液（详见配方）。
附：
胰酶消化液配方（500ml）
NaCL4g
KCL（19%）1ml
Na2HPO40.126g(12H2O)
Tris1.5g(三羟甲基氨基甲烷)
以上药物充分溶解后加水至500ml，然后再加胰蛋白酶5g，最后用1NHCL调pH至7.7，过滤除菌分装，然后-20℃保存备用。
EDTA液配方（0.2%1000ml）
EDTA(versene)2g
NaCL8g
KCL0.2g
Na2HPO4(12H2O)2.9g
KH2PO40.2g
以上药物同样充分溶解后，加新鲜的三蒸水至1000ml，分装然后高压15磅30分钟灭菌，最后4℃保存备用。
细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜（DMSO）10℅混合;-20℃冰箱保存备用。或小牛血清30℅，1640培养液60℅，DMSO10℅混合;-20℃冰箱保存备用。
体外受精胚胎移植细胞培养中霉菌污染的调查
魏凌云
生殖科体外受精胚胎移植细胞培养中被霉菌污染。经调查，病人夫妇无霉菌感染；消毒隔离制度不完善，对培养室和培养箱内物体表面、空气以及超净工作台表面等采样、检测，细菌总数超标率达65％（13/20），霉菌检出率为40％（8/20）；向培养液中加青霉素或链霉素，或两者联用，对霉菌无效。为此，对培养室进行彻底的湿式清扫，并完善消毒隔离制度；用含有效氯1000mg/L的消毒液擦拭培养室内物体表面，用2％碘酒与75％乙醇溶液消毒培养箱内表面；用紫外线照射及2％戊二醛熏蒸消毒空气。随后再检测，细菌总数均未超标，霉菌均未检出。
