（2）目的片段与T载体的连接和转化
采用PromegaT载体克隆试剂盒（pGEM-TEasySystemIkit）进行DNA片段克隆，具体步骤如下：
1）按下表混合各反应成分；
T载体连接反应体系
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试剂 |
标准反应 |
阳性对照 |
空白对照 |
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10×T4连接缓冲液 |
0.5µl |
0.5µl |
0.5µl |
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pGEM-T载体（50mg/ml） |
0.5µl |
0.5µl |
0.5µl |
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PCR产物（回收） |
2.5µl |
―― |
―― |
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阳性对照 |
―― |
1µl |
―― |
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T4-DNA连接酶（3U/µl） |
0.5µl |
0.5µl |
0.5µl |
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dd H2O |
1µl |
2.5µl |
3.5µl |
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总体积 |
5µl |
5µl |
5µl |
2）4℃，连接过夜；
3）每个连接反应准备两个含氨苄青霉素的LB培养基，使用前半小时均匀涂布IPTG和X-Gal在平板表面；
4）将感受态细胞放入冰盒中，解冻后迅速加入2μL待转化的质粒DNA溶液，混匀。
5）在超净工作台上取950μL37℃预热的LB到最小的锥形瓶中，迅速拿到电转化仪旁。
6）将菌液靠壁全部加入电转化杯中，在桌面上敲两下。设置电击参数：
7）1,300V，5ms，按下start开始电击。迅速取出电击菌液，将预热好的LB加入，用枪将槽中菌液轻打混匀，并将所有菌液全部转入5mL管中，
迅速置于37℃摇床，150rpm，培养1小时。
8）取菌液50~100μL涂布在含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培养过夜，筛选转化子。注意要设空白，及质粒DNA对照。
（3）克隆片段的检测－1
1）在LB平板上挑取白色单菌落，置于2ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12-16小时；
2）4℃、12,000rpm离心30秒，收集细胞沉淀；
3）碱裂解法提取并纯化质粒DNA；
①将细菌沉淀，菌体重悬于100µl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡；
②加新配制的溶液II200µl，盖紧管盖，迅速颠倒混匀，将离心管放置于冰上；
③加150µl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟；
④用微量离心机于4℃、12,000rpm离心5分钟，将上清液移到另一离心管中；
⑤加等量酚：氯仿（V/V），振荡均匀，用微量离心机于4℃、12,000rpm离心2分钟，将上清液转移到另一离心管中；
⑥用2倍体积的乙醇沉淀双链DNA；
⑦用微量离心机于4℃、12,000rpm离心5分钟；
⑧小心吸取上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使其中液体流尽；
⑨用1ml75%乙醇洗沉淀的DNA，在空气中干燥10分钟，加入适量TEbuffer（10-20µl）溶解；
（溶液I、溶液II、溶液III的配制见表9）
质粒DNA的提取试剂
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溶液I |
溶液II |
溶液III |
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50mmol/L 葡萄糖 |
0.2mol/L NaOH （用前配制） |
5mol/L乙酸钾（60ml） |
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25mmol/L Tris.HCl（PH8.0） |
1％SDS |
冰乙酸（11.5ml） |
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10mmol/L EDTA (PH8.0) |
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蒸馏水（28.5ml） |
以相应的插入片段的PCR引物对抽提的质粒DNA进行扩增（条件与第一次PCR相同），然后在0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的插入片段及插入片段大小
