（1）pGEM®-TEasy载体系统
I.描述
pGEM®-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。这种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)和pGEM®-TEasy载体，并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率，因为3’-T突出端可以防止载体的自身环化，并且为热稳定性聚合酶（1，2）产生PCR产物提供一个匹配碱基。如表1总结的，这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的3’端加上一个脱氧腺苷酸（3，4）。pGEM®-TEasy高拷贝数载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子，其侧翼和多克隆位点区相接，多克隆位点区位于β半乳糖苷酶的α肽编码区内。α肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。另外这两个载体的多克隆位点区的限制性酶切位点适用于采用Promega公司Erase-a-Base®系统（产品目录号#E5750）产生一系列巢式缺失体。
pGEM®-TEasy载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点，采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如pGEM®-TEasy载体多克隆区的EcoRⅠ、BstZⅠ和NotⅠ酶切位点。这种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。
pGEM®-TEasy载体含有丝状噬菌体f1复制起始子，可用于制备单链DNA(ssDNA参见第Ⅶ部分)。单链DNA分子对应于图1底部一条链，代表pGEM®-TEasy载体。
pGEM®-TEasy载体系统包含2×快速连接缓冲液，用于连接PCR产物。采用这种缓冲液进行连接，在室温孵育1小时即可完成。延长孵育时间可增加转化克隆菌数目。一般4℃过夜连接可产生最多的转化子。
表1.部分热稳定性DNA聚合酶所产生的PCR产物特性的比较。
热稳定性DNA聚合酶
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特性 |
Taq/ AmpliTaq® |
Tfl |
Tth |
Vent®/(Tli) |
Deep Vent® |
Pfu |
Pwo |
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PCR 产物末端 |
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>95%平端 |
>95%平端 |
平端 |
平端 |
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有 |
有 |
有 |
无 |
无 |
无 |
无 |
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无 |
无 |
无 |
有 |
有 |
有 |
有 |
II. 载体图谱
GEM®-T Easy 载体的启动子及多克隆位点区序列 。上部序列链对应于用T7 RNA 聚合酶合成的RNA 序列，底部序列链对应于用SP6 RNA 聚合酶合成的RNA 序列。
pGEM®-T Easy 载体环形图谱及相关的序列位点
pGEM®-TEasy载体相关的序列位点：
T7RNA聚合酶转录起始位点1
多克隆位点区10－128
SP6RNA聚合酶启动子（－17至＋3）139－158
SP6RNA聚合酶转录起始位点141
pUC/M13反向测序引物结合位点176－197
lacZ起始密码子180
lac操纵子200－216
β内酰胺酶编码区1337－2197
噬菌体f1区2380－2835
lac操作子序列2836－2996,166－395
pUC/M13正向测序引物结合位点2956－2972
T7RNA聚合酶启动子（－17至＋3）2999－3
