step1      94℃      5 min        预变性
step2      94℃      1 min        变性
step3      X℃       1 min        复性
step4      72℃      y min         延伸
step5      GO TO     step2       30循环
step6      72℃      10 min        延伸
step7      4℃       10 min        保温
step8      End

扩增产物于0.8%的琼脂糖凝胶80伏电泳2 h，溴乙锭染色，凝胶成像仪观察分析扩增结果。若扩增谱带明显，并具有特异性，则挖带进行进一步扩增；若扩增谱带不明显，或特异性较差，则改变PCR条件，直到扩增出特异谱带。
凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青FF；40％（w/v）蔗糖水溶液；1×TAE
在琼脂糖凝胶中溴酚兰相当于35bp，二甲苯青相当于130bp。

目的DNA片段的进一步扩增
1 在长波紫外灯下切取特异的扩增谱带
2 将挖取的琼脂糖凝胶置于1.5ml Eppendorf管中，加50µl TE，用枪头捣碎凝胶后于45℃水浴30min。
3 离心5分钟后，取上清夜继续进行PCR，反应条件同第一次PCR。

取5μL检测是否为特异单带。若为特异单带，则直接用2倍预冷的乙醇沉淀（加1/10体积5mol/LNaAc，2倍体积乙醇，-20oC放置1小时或过夜。离心(12000g,20min)，沉淀用75%洗2次，DNA自然晾干，溶于1mol/LpH8.0的TE溶液中，贮于4℃待用）；若为多带，则琼脂糖凝胶电泳后，在长波紫外灯下切取目的DNA片段，用DNA回收试剂盒回收。

2．用E.Z.N.A.GelExtractionKit进行回收
a)用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在紫外灯下切取目的片段，放入Eppendorf管。并称重。
b)每管加入等体积的Bindingsolution(约100μL/0.1g)，60℃水浴7min至凝胶完全融化，其间温和地混合几次。c)在Hind®DNAspin中加入700μLDNA/琼脂糖混合液。室温下，10,000rpm，离心3min，去上清。若DNA/琼脂糖混合液体积大于700μL，每次取700μL，连续装柱、离心。(注：每柱最多回收25~30μgDNA)
d)加入300μLBindingbuffer，室温下，10,000rpm离心10min，弃上清。
e)每管加入700μL的无水乙醇稀释的spwbuffer到柱中，静置3min，室温下，10,000rpm离心1min。
f)弃上清，10,000rpm离心空管1min。
g)转移柱至一个干净的1.5mL离心管中，每管加20μLDNAElutionbuffer，室温下，10,000rpm离心1min。上清夜即为纯化的DNA片段。

3.目的片段的克隆
纯化的片段连接到克隆载体pGEM-Tvector，转化导入宿主菌E.coliDH5α，通过蓝白斑筛选，PCR扩增鉴定后测序，获得的含所需要的目的片段的质粒。

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