50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然后计算出每毫升血清中补体含量。

以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵坐标，可得到一个清晰的“S”形曲线。在50%溶血周围，线段近似一条直线。因此当补体用量稍有变动，就可对溶血程度发生很大影响。所以用50%溶血作为终点要比100%溶血更为敏感。
50%溶血试验定血清中补体含量用以下公式表示：

该公式可以从Von Krogh 方程式进一步加以论证：

假定X=加入的新鲜血清量
      y=溶血的百分率，以小数表示
      V=斜率
      k=常数
 
转变成对数，上述公式就变成

材料及器材
1．稀释液（磷酸盐缓冲生理盐水）
NaCl                        17g
Na₂HPO₄                               11g
KH₂PO₄                      0.27g
蒸馏水                      100ml
使用时取此原液50ml，加90ml蒸馏水。经高压灭菌后即可使用。加入100%硫酸镁溶液1ml，可增强补体的效能。
2．绵羊红细胞悬液（1×10g/ml）
3．溶血素（2U）
2．被检血清（新鲜豚鼠血清）
3．水平离心机
4．水浴箱
5．721型分光光度计
方法：
1．浓度为1×10g/ml的绵羊红细胞配制
取经稀释洗涤后的绵羊红细胞配成较5%稍浓的细胞悬液。
取50%细胞悬液1ml，加于14ml蒸馏水中测 O.D值为Di按下式求出于一定体积的5%细胞悬液中应加入稀释液的毫升数。


2．致敏绵羊细胞
取绵羊红细胞悬液（1×10²／ml）加等量的溶血素（2U／ｍｌ）。充分混合。置37℃水浴中作用30分钟，每隔10分钟摇动一次以免细胞下降即成5×10⁸／ml致敏羊红细胞。
3．补体CH50单位测定
 ⑴　按下表加样：

⑵　将各管充分混合。置37℃水浴中60分钟（摇动1～2次，以免红细胞下沉。）
⑶从水浴中取出后，立即将各管以2000转／分离心10分钟，将各管上清液分别移于另一试管。
⑷测定各管上清液ＯＤ值（波长＝540ｎｍ）
4．补体ＣＨ50单位的计算
从测定管（第1～5管）及溶血对照管（第６管）的ＯＤ值中减去红细胞对照管（第7管的ＯＤ值。再减去按待测血清每管实际用量计算出的血清色度ＯＤ值（80／800ⅹ该管实际量ⅹ第8管ＯＤ值）。即为测定管的校正ＯＤ值。然后计算各测定管的溶血率（ｙ值）

再计算各管的ｙ／（１－ｙ）值。
在双对数坐标纸上，以ｙ／（１─y）值为横坐标，血清用量为纵坐标，得到一条直线。由于50%溶血（y=0.5）的y/(1─y)值等于1。即可由横坐标等于1的一点，在直线上求得在纵坐标上相应的截距，此即产生50%溶血的待测血清实际用量。
    最后，按下列公式计算出每毫升待测血清的总补体活性，以单位/毫升表示之。