基本原理
NK 细胞克隆来源于NK 细胞，该细胞的分离方法参见第一节之四。这些NK 细胞与经γ射线照射的饲养细胞苓而获得的NK 细胞克隆。

试剂和材料
● 植物血凝素（PHA）母液为100μg/ml
● 重组IL－2（rIL－2）母液为105u/ml，分装小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃长期保存，或置4℃下短期存放。应避免反复冻融，IL－2 不能用滤器过滤除菌处理。
● 培养基
1.接种培养液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠。
2.饲养细胞培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠。
3.NK 克隆培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠，经0．2u 滤板过滤再加入100u/ml IL－2。
4.培养液：RPMI1640＋10％FCS。
● 饲养细胞：自体或同种异体PBMC
● 器皿和仪器：96 孔细胞培养板、多头移液管、微量移液管、倒置显微镜、CO₂ 孵箱、低温离心机、垂直气流超净台

实验操作
1.NK 细胞的制备
1） 制备NK 的方法参见第一章之第四节。
2） 悬浮NK 于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。
2.接种NK 细胞
1） 制备饲养细胞（PBMC）方法参见第一章第一节。
2） 于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。
3） 被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。
4） 用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g 离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×10⁶/ml。
5） 在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1．2×10⁸ 个饲养细胞）。
6） 将96 孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。
7） 将NK 细胞悬浮于接种培养液中，并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞，使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。
8） 将培养板置5％CO₂ 孵箱中37℃培养。
3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3 天，主要依赖于饲养细胞）
1） 从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。
2） 每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×10⁶ 细胞/ml）的NK 克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下：
（1） 融化饲养细胞，移至50ml 试管中。
（2） 轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。
（3） 用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。
（4） 按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×10⁶/ml。
4.换液（6－8 天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。
5.检测NK 细胞的生长状况（9－10 天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。
6.分离克隆（11－15 天）
1） 当培养液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96 孔板上将生长的NK 按1 孔分为2 孔，2 孔分为4 孔，4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。
2） 在96 孔板上扩增克隆，并重复第7 天的操作。

质控与提示
1.每天需检查细胞生长情况。
2.NK 细胞克隆只生长在96 孔板上，NK 细胞总是用96 孔培养板进行克隆培养。
3.目前了解，鼠NK 细胞克隆的制备仅限于短期培养。