[原理]
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。
在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。
式中 v——反应速度；
Km——米氏常数；
Vmax——酶反应最大速度；
[S] ——底物浓度。
从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。
在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。
测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线(见图)。直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。
