（二）鸡胚培养法
鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，它的主要优点是鸡胚来源充分，操作简便，管理容易，本身带病毒的情况少见，只要选择适当的接种部位，病毒很容易增殖，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。
1、鸡胚的孵育法
（1）孵育：选新鲜、10天以内的、壳白净且厚薄均匀的鸡卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程中便于检查，为首选）。
将受精卵放入孵箱内，气室向上，孵育的最适温度为38-39℃，相对湿度为40-70％，孵育3日后，鸡卵应每天翻动1-2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
（2）检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：4日后只见模糊卵黄暗影，无血管，亦无小黑团（鸡胚）。应将其挑捡出来。
②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），其后逐渐增大，边缘清楚，鸡胚本身可见有明显之自发性转动。
③死胚：如果发现鸡卵血管模糊、断折甚至完全看不见血管，胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。
2、接种方法
病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表13-1、图13-1）。
表13-1 鸡胚孵育日龄及接种途径选择
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接种病毒名称 |
接种部位 |
鸡胚日龄 |
收获材料 |
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痘类病毒、单纯疱疹病毒 |
绒毛尿囊膜 |
9～10 |
绒毛尿囊膜 |
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流感病毒、腮腺炎病毒 |
尿囊腔 |
9～11 |
尿囊液 |
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流感病毒初次分离 |
羊膜腔 |
12～14 |
羊水 |
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某些嗜神经性病毒 |
卵黄囊 |
5～6 |
卵黄液 |
图13-1 鸡胚培养法常用接种途径
现将尿囊腔接种法叙述如下：
尿囊腔接种
此方法主要用于流感病毒、新城鸡瘟病毒、腮腺炎病毒等的适应和传代。这些病毒能在尿囊膜细胞内增殖，并将增殖的病毒释放到尿囊液中，这一方法也可用于制备疫苗和制备抗原。
【材料】流感病毒（10-8稀释）液体，9-11日龄鸡胚、灭菌1毫升注射器、7号针头、锥子、蛋座、检卵灯、镊子、碘酒和酒精棉球、胶布等。
【方法】
1、选9-11日龄鸡胚，照检后划出气室边缘和胚胎位置，在气室边缘上2-3毫米无大血管处作一标记。
2、将鸡胚置蛋座上，消毒标记处，用蛋钻钻一小孔。
3、用灭菌注射器吸取流感病毒液0.1-0.2ml，由小孔刺人0.5－1cm 后，进行注射。（见图13-2）
4、注射后，用酒精消毒过的胶布封口，置35℃孵育72小时。
5、每日在灯下检视鸡胚情况，若鸡胚在接种后24h内死亡的应弃去。
6、孵育72小时后取出，放4℃冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固，次日取
出鸡胚，收获尿囊液。
7、收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，无菌剪刀击破气室端卵壳，将卵壳剥去，用小镊子在无大血管处撕破卵膜，然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用无菌吸管刺破尿囊，吸取尿囊液，直至吸尽为止。每胚可得5-7ml，置无菌小瓶内低温保存，留作血凝试验或病毒鉴定或进行传代培养。同时应滴2滴尿囊液于无菌肉汤中做无菌试验。
图13-2 鸡胚尿囊腔接种
（三）组织培养法
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制研究、生产疫苗和抗原等。组织培养法的组织来源多种多样，如各种动物组织、鸡胚组织、人胚羊膜组织或人胚组织等，主要根据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴的组织较敏感、因此，研究人的病毒性疾病常用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。本实验仅介绍原代鸡胚肌皮细胞培养方法。
