² Morphological data so far are most reliable and convincing evidence for apoptosis， especially with electromicroscopy
² Morphological analysis should be included together with other parameters
² Different methods may suit different cell types
² The time-course of apoptotic events are important for selection of the methods
² Flow cytometry is the most useful and powerful in apoptosis research
一、形态学研究方法 （Morphological methods）：
1、普通显微镜 ： 凋亡细胞变小、变形、细胞膜完整、发泡现象，晚期可见凋亡小体。
Giemsa 核染料：染色质浓缩、凋亡小体。
2、电子显微镜：细胞质浓缩、核变小、晚期核碎片成凋亡小体。
3、操作步骤 （Morphological methods）：
（1） 普通显微镜：将培养有细胞的24孔培养板于倒置显微镜下观察，观察经过诱导、和未诱导组的细胞形态、大小和细胞凋亡小体，照相记录。
（2）电子显微镜：5x106 细胞，加25%戊二醛固定，再用1%哦酸固定，将细胞置于丙酮：包埋基（1 ： 1）中2小时，切片，透射电镜观察。可见细胞膜完整，核变小，染色质浓缩并结块/沿核膜内侧排列，晚期核裂解为碎片产生凋亡小体。
二、生物化学研究方法：
1、原理：染色质核小体单位 断裂 50~300kb，或180~200 bp整倍数片段（DNA ladder）。
2、设备：离心机、Agarose电泳装置，X-底片，照相系统
3、步骤：（1） 5 x 106 细胞，加裂解液，离心，酚 / 氯仿提取细胞DNA，Agarose电泳，EB染色，拍照。
（2） 细胞量很少时，可用32P-ATP加脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）标记DNA，电泳、放射自显影，观察DNA ladder。
三、分子生物学研究方法：
1、TdT介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucletidyl transferase mediated nick end labeling ， TUNEL）：
原理：染色质核小体单位 断裂 50~300kb，30% 酶切成180~200 bp片段，3’-OH缺口可在TdT作用下将标记有荧光素、生物素、过氧化酶等的核苷标记到3’-末端。正常细胞DNA很少断裂，很少被染色。
2、荧光素标记测定法：
（1）原理： 地高辛-11-dUTP在TdT作用下 标记到3’-末端 。荧光素标记的地高辛抗体进行检测。可在激发光494 nm时产生523nm的发射光，可在荧光显微镜下计数或使用流式细胞仪进行定量。信号强度比正常细胞高28倍，比坏死细胞高10倍。
（2）特点：1、可测定早期凋亡细胞；
2、可测定DNA发生断裂的时相；
3、地高辛/抗地高辛标记系统特异性好；
4、适用于石蜡组织切片、冰冻组织切片，培养或分离的细胞的凋亡测定。
（3）设备：荧光显微镜/流式细胞仪，离心机，染色缸，水浴。
（4）步骤： 将5x106 细胞加入1%副甲醛，固定15 min，离心，加70%乙醇，-20°C保存，洗涤，加TdT 2滴和50 ul 反应液。离心，洗涤，加100 ul荧光素标记的地高辛抗体，加1 ml碘化丙啶 （PI），染色15 min，流式细胞仪测定。荧光素标记的地高辛抗体可产生523nm的发射光（绿色荧光），代表凋亡细胞；在620 nm处PI产生红色荧 光，代表其余全部细胞数目。
四、免疫组织化学方法：
1、原理：染色体裂解成核小体DNA，并与组蛋白H2A、H2B、H3、H4 紧密结合，保护DNA 。用抗组蛋白和抗DAN的抗体ELISA法，提高灵敏度并能测定早期凋亡细胞。
2、方法：抗组蛋白抗体包被酶标板，加入含有核小体的待测细胞裂解液，加入抗DNA 抗体-POD （可与核小体中的DNA结合），加底物DAB，酶标仪测定。
3、设备：试剂盒（Boehringer Mannheim），酶标仪，酶标板。
