近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
一、抗病基因克隆的方法
（一）功能克隆
功能克隆即已知基因编码产物的克隆方法。当目的基因序列未知,但其编码产物的生理生化及代谢途径研究得比较清楚时,就可以采用这种克隆方法。功能克隆根据克隆基因的原理又可分为两条路线,一条是分离纯化已知的蛋白质或多肽,制备该蛋白的特异抗体,利用标记的特异蛋白抗体作为探针筛选由表达型载体建立的基因组文库或者cDNA文库,通过免疫杂交筛选到重组克隆,并最终克隆目的基因;第二条路线是将蛋白质纯化后测定其N 端一段氨基酸序列,根据蛋白质密码子编码规律和密码子偏爱原则,反向推算出mRNA序列,然后据此人工合成一段寡核苷酸作探针,利用同位素或其它方法标记后筛选一般的基因组文库或cDNA 文库,筛选阳性重组克隆,并最终克隆目的基因。
随着植物抗病反应的深入研究及蛋白质分离纯化技术的发展,相信功能克隆的策略会发挥重要作用,但一部分抗病基因的产物及表达调控特性尚不清楚,因此在一定程度上也限制了该策略的应用。
（二） 定位克隆
定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,目标基因精确定位在染色体特定位置之后,用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基因组文库(如BAC和YAC) ,通过染色体步行筛选到含有目标基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。其核心任务是染色体步行,如果能找到与目标基因很近的标记,以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小,就可以直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因,这种策略称为染色体登陆。
到目前为止,利用定位克隆策略,单基因性状相关基因的鉴定方法已较完善且取得了一个系列成果,已使几十种重要的基因得到了分离。但定位克隆技术需要寻找与目标基因座位连锁的遗传标记或部分功能信息。有时需连锁作图,较费时费力。而且在植物的基因组中,大量存在DNA 重复序列经常是染色体步移难以逾越的障碍。
（三） 序列克隆
序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列时采用的方法。这种情况下,可以从DNA 序列数据库(如GenBank 数据库) 中查找有关基因的序列,然后可以设计并合成一对寡核苷酸引物,提取所要分离基因的植物染色体DNA 或者用RNA 在逆转录酶的作用下合成cDNA 的第一条链,以此为模板,采取PCR 或RT-PCR 的方法来克隆基因。扩增的片段经纯化后,连接到合适的载体上,经酶切和序列分析并与已知的基因序列作比较。
此方法简便快速,国内利用此方法已经克隆了豌豆外源凝集素基因。有时要从其他的种、属中克隆同源基因时,可以先比较序列已知的基因序列,寻找比较保守的区域,根据此区域的序列设计并合成探针,然后从cDNA 文库或者基因组文库中筛选到目的基因的克隆。如利用酵母菌乙酰乳酸合成酶的基因序列,已从烟草和拟南芥中克隆出抗除草剂的乙酰乳酸合成酶基因。Payne G. 等根据烟草中酸性几丁质酶和碱性几丁质酶的氨基酸序列C 端的同源率为65 % ,以已知的碱性几丁质酶的核酸序列为探针,从烟草的cDNA 文库中筛选了两种酸性几丁质酶的基因PR-P 和PR-Q。

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