要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3μL进行酶切。
A质粒酶切－制作载体片断
公用Buffer 3μL
酶 I 1μL
酶 II 1μL
质粒 3μL
双蒸水 22μL
合计 30μL
混匀
37℃，酶切3小时。
1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）
1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）
3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。
4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。
5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）
6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。
7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。
8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。
9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）
10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风）
连接
向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）
三、 一步法感受态细胞制作（已经检验过DH5α和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）
来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580
Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.
Chung CT, Miller RH.
下载链接：http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520&pageindex=1
（提示：建议首次使用本方法时，先培养20mL菌，可得到总数2mL的感受态菌，足够作30次转化。制作感受态细胞时注意无菌操作。）
1. LB medium 培养至 OD值 0.3-0.5。
2. 4℃ 3000g（或6000rpm） 5分钟。弃上清，收菌。
3. 重悬于原培养体积1/10的TSB中。
4. 冰上置10分钟。 分装，每管60μL，置冰上。放入－70℃冰箱。（提示 每次使用拿出一管，避免反复冻融。 －70℃可保存一年不影响转化效率）
