3．吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
4．将细菌沉淀重悬于200μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl（pH8.0）
10mmol/L EDTA（pH8.0）
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，高压下101bf/m2（6.895×104pa）蒸气灭菌15min，贮存于4℃。
5．加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH
1% SDS
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。
6．加200μl溶液Ⅲ
溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
盖紧管口，将管倒置，温和振荡10min，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。
7．用微量离心管于4℃以12000g离心5min，将上清转移另一离心管中。
8．加等量酚和氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心2min，将上清转移到另一离心管中。
9．用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。
10．用微量离心机于4℃以12000g离心5min。
11．小心吸去上清液，将离管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
12．用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤1所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀，干燥10min。
13．用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μl/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。
14．用适当限制性内切酶分析所得DNA。
五、M13噬菌体重组DNA分子导入大肠杆菌
1．感受态细胞的制备
（1）将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。
（2）将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。
（3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris·HCl（pH8.0）无菌冷冻液体中。
（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。
（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0）无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。
2．转化程序
（1）取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常≤50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min。
（2）将管放于42℃水浴中2min。
（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h，干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。
（4）每200μl转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。
（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于30～37℃培养箱中18～22h。克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。
