评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。（codegreen）
6)detergent- based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。
总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。
到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。
2、分离膜蛋白的方法（操作）
1）分离细胞膜蛋白的方法：
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2）分离细胞膜蛋白的方法：
1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
3）分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。
4）分离组织膜蛋白的方法：
1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管， Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。
