（4）Primer 5’未端可修饰、突变:
修饰  
如：³²P、生物素、荧光素，不影响其效果  

突变： 
AGCTCCATGACCCAG 
5’CGCTCCATGACCCAG   3’ 

注意：绝不可以在3’端进行上述改造 
∵DNA聚合酶是5’→3’聚合，若3’端改造→不能互补→不能延伸

(5）primer  5’端增加碱基


②ATG起始密码 
③TAA、TAG、TGA终止密码 
如：  可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。
3.模板：
可选：DNA  
  mRNA→逆转录→cDNA 
DNA包括：  质粒      噬菌体      染色体DNA 
                       较小       较大       ①目的gene是单拷贝 
                 变性较易   变性较难     ②非常大，变性难 
模板用量 
Plasmid:lng 
Chromosome:300-500ng 
注意：  防止交叉污染  
4.dNTP：
四种脱氧核苷酸，基本原料
终浓度：50mM   
注意：不稳定，保5.Mg²⁺ 
 TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ 
 不同的酶需不同Mg²⁺  
 Taq：较少，Mg²⁺对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度 
 pfu：Mg²⁺ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍 
 外界影响： EDTA鳌合Mg²⁺ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg²⁺结合， 降低Mg²⁺有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的  Mg²⁺浓度 存时间长会失效
6.温度和时间：
（1）变性温度：94-95℃
      Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑
（2）退火：温度越高，扩增特异性越好
取决于Tm值：Tm↑退火T↑；
            Tm↓退火T↓
若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度
（3）延伸：
£500nt---1min    >500nt－－3min
一般：40－60sec
（三）PCR技术的应用
1. 基因检测：
2. 基因克隆化
3. DNA突变
4. DNA序列分析

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