（2）以上述同样的方法取血，并使血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白。然后以转化液作空白，测定标本吸光度A。
（3）通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度，即
Hb（g·L-1）=K×A (6.2-2)
3.使用沙里氏血红蛋白计测定
沙里氏比色法是用HCl使血红蛋白酸化形成棕色的高铁血红蛋白，然后和标准比色板进行比色。
（1）沙里血红蛋白计 主要具有标准褐色玻璃比色箱和1只方形刻度测定管组成。比色管两侧通常有两行刻度；一侧为血红蛋白量的绝对值，以g·dl-1(每100 ml血液中所含血红蛋白的克数)表示，从2～22 g；另一侧为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，从10%～160%。为避免所使用的平均值不一致，因此一般采用绝对值来表示。
（2）具体测定方法如下：
①用滴管加5～6滴，0.1mol·L-1 HCl到刻度管内,(约加到管下方刻度”2”或多或10%处)。
②用微量采血管吸血至20 μl(方法同上述)，仔细揩去吸管外的血液。
③将吸血管中的血液轻轻吹到比色管的底部，再吸上清液洗吸管3次。操作时勿产生气泡,以免影响比色。用细玻棒轻轻搅动，使血液与盐酸充分混合，静置10 min，使管内的盐酸和血红蛋白完全作用，形成棕色的高铁血红蛋白。
④把比色管插入标准比色箱两色柱中央的空格中。
⑤使无刻度的两面位于空格的前后方向，便于透光和比色。用滴管向比色管内逐滴加入蒸馏水，并不断搅匀，边滴，边观察、边对着自然光进行比色，直到溶液的颜色与标准比色板的颜色一致为止。
⑥读出管内液体面所在的克数，即是每100 ml血中所含的血红蛋白的克数。比色前，应将玻棒抽出来，其上面的液体应沥干净，读数应以溶液凹面最低处相一致的刻度为准。换算成每升血液中含血红蛋白克数（g·L-1）。
[注意事项]
1.取血前要做好充分的消毒。
2.血液要准确吸取20 μl，若有气泡或血液被吸入采血管的乳胶头中都应将吸管洗涤干净，重新吸血。洗涤方法是：先用清水将血迹洗去，然后再依次吸取蒸馏水、95%酒精、乙醚洗涤采血管1～2次，使采血管内干净、干燥。作为学生练习，微量采血管可反复使用。
3.使用血红蛋白仪测定时，吸样管应插入试管底部，避免吸入气泡，否则会影响测试结果。仪器连续使用时，每隔4小时要观察一次零点，即吸入文齐试剂，用“调零旋钮”使仪器恢复到零点。仪器用完后，关机前要用清洗液清洗。否则会影响零点的调整。
[实验结果]
报告该实验动物的血红蛋白浓度。并将全班的结果加以统计,用平均值±标准差表示。
[思考题]
血红蛋白的含量与年龄的关系？
影响血红蛋白含量的主要因素？
[附]：
※1.HiCN转化液：即文齐氏液，有标准商品出售。也可配制： 高铁氰化钾(K3Fe（CN）6)200 mg，氰化钾（KCN）50 mg，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）140 mg，Triton X-100 1.0 ml，蒸馏水加至1000 ml。过滤后为淡黄色透明液体，pH 7.0～7.4，置有色瓶中加盖、冷暗处保存。如发现试剂变绿、变浑浊则不能使用。
2.用分光光度计直接测定血红蛋白
（1）取血、血红蛋白转化和比色同前述1、2的方法，得到标本的吸光度A。
（2）根据标本吸光度A直接计算出血红蛋白浓度：
式中 A：为波长540nm处标本吸光度。
44：为HiCN在波长540nm，光径1.0cm条件下的毫摩尔消光系数（L· mmol-1· cm-1）。
64485（mg）：为Hb的毫克分子量，即1 mmol·L-1 Hb溶液中的Hb毫克数。
1000：为将mg转变为g。
251：为血液稀释倍数。
因是通过分光光度计比色直接计算出血红蛋白浓度，因此分光光度计的波长和光程必须准确、灵敏度要高、线性好、无杂光，否则会影响结果的准确性。故仪器的校正在测定中十分重要。
上述介绍的几种方法中，以分光光度计直接测定和比色法测定血红蛋白较为精确，但对分光光度计的精密程度要求较高，分光光度计校正起来较为麻烦。沙里氏血红蛋白计测定操作简便适于基层单位，但准确性稍差。血红蛋白计操作较为简便，因有标准的商品试剂出售，因此也比较精确，目前普遍被医疗单位使用。
