[仪器与器材]
聚苯乙烯板(酶标板)，酶标测定仪，试剂瓶，微量加样器及塑料吸头(50 ?l，200 ?l，1000 ?l)，恒温水浴锅，水箱，磁力搅拌器。
[实验方法和步骤]
1.酶标板的预处理 新制的酶标板含有有机成分，使用前先用无水乙醇浸泡二小时以上，再用蒸馏水冲洗干净，37℃烘干或阴干。
2.制作孕酮抗血清稀释度曲线及选择孕酮抗血清工作浓度 将孕酮抗血清稀释成不同浓度，包被同一酶标板的不同孔眼后,测其光密度,其目的选择最适抗血清稀释工作浓度。随着抗血清浓度的下降，光密度也随之下降，一般初选光密度值为1.0左右时的稀释度为孕酮抗血清的工作浓度(图13.7-1)。
3.制作酶标孕酮稀释曲线及选择酶标孕酮工作浓度 以初选的抗血清稀释度包被酶标板，将酶标孕酮稀释成不同浓度，绘出酶标孕酮稀释曲线(见图13.7-2)，选择斜率最大并有一定光密度值的稀释度为工作浓度。
4.酶联免疫分析的操作步骤 （按表13.7-1程序进行）
(1)加孕酮抗体 酶标板第一纵列为空白,加包被液200μl作为参比孔，其他各列均加最适稀释度的孕酮抗血清200 u1稀释好的抗血清，置4℃冰箱过夜。
(2)冲洗未吸附的游离抗体 取出包被28 h以上的酶标板。吸去孔内液体，用冲洗缓冲液洗三次，吸干。
(3)加待检奶样或标准孕酮 在空白孔和0标准孔中加100 ?l去激素（孕酮）奶；其它标准孔中，每孔加100 ?l标准孕酮；样品孔中加5倍稀释的脱脂奶样100 ?l。每个样品至少有二个重复。
(4)加酶标孕酮 每孔加以所选最适稀释浓度的酶标孕酮100 u1。
(5)温育酶标准板置37℃恒温箱3 h。
(6)冲洗未结合的孕酮， 同(2)。
(7)显色反应 每孔加200 ?l新鲜配制的底物液，室温放置45～60 min，或37℃30 min，让其充分显色。
(8)终止反应 每孔加50 ?l 2 mol·L-1H2SO4,终止酶促反应。
(9)检测 用酶标测定仪检测波长450 nm处的光密度值(OD450)。
5.计算 测得样品的OD值或结合率(占0管OD值的百分比)，可从标准曲线上直接查到相的孕酮含量。
[注意事项]
1. 用于包被的抗血清浓浓度必须合适，过高就不存在结合的竞争性。
2.奶样中含有对测定的干扰物，因此标准品用脱激素奶样稀释，可以校正非特异性。
3.免疫反应温度不能超过40℃，不利于抗原抗体结合物的生成，且易使酶和抗血清的活性降低。一般37℃温育3 h，38℃温育2.5 h。
4.所用微量加样器，要求吸样准确，应进行检查校正。
[实验结果]
绘制标准曲线图，并报告样品测定结果。
