[实验目的要]
      通过对乳汁中孕酮含量的测定，了解酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay，ELISA)的基本原理与检测技术。
 [实验原理]
    酶联免疫吸附分析法（ELISA）是通过化学的方法将酶与抗原或抗体结合，形成酶标记物（或通过免疫学方法将酶与抗酶抗体结合，形成免疫复合物）。这些酶标记（复合）物仍保持其免疫性和酶活性，再与相应的抗体或抗原发生反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶，在遇到相应酶底物时，经催化水解及氧化还原等反应，形成有色产物。酶降解底物的量与呈现色泽浓度成正比。由此，可反映被测定的抗原或抗体的量。
    与RIA法相似，利用被测抗原与酶标记抗原对特异性抗体进行竞争结合，测试(加入的)标记在抗原上的酶催化底物所产生的颜色反应。当特异性抗体量一定时，且小于被测和标记抗原时，未标记抗原浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中抗原含量呈负相关。

   以标准抗原不同浓度为横坐标，以比色的光密度值(OD)或相应的结合率(OD/ODo%)为纵坐标，绘制标准曲线。根据被检样品的结合率在标准曲线上可查到相应的含量。
   目前人们还可以使一些小分子的类固醇激素（如孕酮）与大的蛋白质分子（如牛血清蛋白）结合，成为完全抗原，并按免疫学原理获得抗体。通过检测酶标记该完全抗原的竞争性结合率，来测定该激素的含量。
 [实验动物]
     奶牛
 [实验试剂]
    发情牛鲜奶，
试剂配制：
  1.孕酮抗血清   用11α-孕酮-牛血清白蛋白(11α-P4-BSA)，免疫兔子所得，效价在1：104以上。
  2.标准孕酮   用脱激素奶将标准孕酮稀释为一系列不同的浓度，如0.125,0.25，0.5，1，2，4，8，16 pg·?l-1。
  3.酶标孕酮(即孕酮-辣根过氧化物酶结合物(P-HRP))   由11α-孕酮-半琥珀酸(11α-P-HS)和辣根过氧化物酶(HRP)，通过共价键连结而成，稀释度大于1：106以上。
  4.包被缓冲液(pH 9.6，0.05 mo1·L-1碳酸缓冲液)，用于稀释抗血清。
Na₂CO₃         1.59 g ；        NaHCO₃       2.93 g
     NaN₃            0.2 g ；        溶于1000 m1蒸馏水中。
  5.测定缓冲液(pH7.0，0.1 mo1·L-1磷酸缓冲液，其中含0.87％NaCl和0.1％牛血清蛋白(BSA)   用于酶标抗原及样品的稀释。
    Na₂HP0·12H₂O         21.85 g，           NaCl        8.70 g  
NaH₂P0₄·2H ₂O         6.08 g，           BSA         1.00 g
  溶于1000 m1蒸馏水中。
  6.底物缓冲液(pH 5.4磷酸盐-柠檬酸缓冲液)   用于底物液的配制。
    柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)    0.47 g,         Na₂HP0₄·12H₂O    2.00 g
    溶于100 m1蒸馏水中。
  7.底物   用于显色。
取10 mg·m1-1四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)或二甲亚矾液(DMSO) 0.2 ml，加入底物缓冲液至5 ml，使用前加50 ?l 0.6％的H202。
  8.终止液(2 mol·L-1H2SO4溶液)     用于终止显色反应。
浓H2SO4 1份，         蒸馏水  9份。
  9.冲洗液(含0.0 5％吐温(Tween)20，pH 7.4的磷酸缓冲液)  用于冲洗酶标板。
    Na₂HP0₄·12H₂0        2.9 g，         KH₂PO₄            0.2 g 
    NaCl                            8.0 g，         KCl                    0.2 g  
    Tween20                     0.5 m1        溶于1000 ml蒸馏水中。
  10.脱激素(孕酮)奶(发情牛奶通过由葡聚糖凝胶包被的活性炭吸附而得)  
 以5.0 g活性炭和0.5 g葡聚糖(G25)溶于250 m1不含BSA的测定缓冲液，磁力搅拌器搅拌30 min，成为用葡聚糖包被的活性炭(DCC)。取DCC一份，加等量奶样,3000 r·min-1离心10 min，取上清液即为脱激素奶。

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