【注意事项】
1．上样前，层析柱要达到平衡
2．上样后要控制流速
3．酶活测定和蛋白定量实验中所用试管、刻度吸管要干燥，量取试剂要准确
【教学内容三】
SDS-聚丙稀酰胺凝胶平板电泳（电泳基本原理、分类、影响因素, SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用途,凝胶制备）
【实验原理】
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳。在蛋白质样品和聚丙稀酰胺凝胶系统中加入带负电荷的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，加之聚丙稀酰胺凝胶具有分子筛效应，此时，蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关。
【试剂】
1． 电极缓冲液（pH 8.3）
0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）
0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）
称3.02克Tris、14.42克甘氨酸，1克SDS，用蒸馏水定容至1000毫升
2．分离胶缓冲液（pH8.8）
1.5 mol/L Tris — HCl
称18.171克Tris，80毫升蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 8.8，蒸馏水定容至100毫升
3．浓缩胶缓冲液（pH6.8）
0.5 mol/L Tris—HCl
称6.075克Tris，80毫升蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 6.8，蒸馏水定容至100毫升
4．凝胶
30%丙稀酰胺（Acr）
1.6%甲叉双丙稀酰胺（Bis）
称30克Acr、0.8克Bis，加少许蒸馏水热溶, 用蒸馏水定容至100毫升
5．染色液
称2.5克考马斯亮兰R－250，加500ml甲醇，100ml醋酸, 用蒸馏水定容至1000ml
6．脱色液
取250ml甲醇，70ml醋酸，用蒸馏水定容至1000ml
7．样品缓冲液
取10%SDS 1ml，二巯基乙醇（13.5mol/L）0.6ml，甘油1.5ml，0.05%溴酚兰少许，0.5mol Tris-HCl(pH6.8)定容至10ml
样品处理：将血清用样品缓冲液稀释至蛋白含量为1mg/ml，煮沸5分钟
8．10%SDS
9．0.05%溴酚兰
【实验步骤】
1．配胶（分离胶，浓缩胶），如下表：
2．配封板胶，封板，组装电泳槽
3．灌入分离胶，缓慢加入1～2cm高度蒸馏水，使重叠于胶面上，待分离胶凝固后，倒出胶面上层水，剩余的水用滤纸吸干
4．灌浓缩胶，插入梳子
5．胶凝固后，拔出梳子。在梳子孔中加入处理好的样品50μl
6．样品处理：将每次留取的各管样品，稀释到2mg/ml，取稀释液按样品：样品缓冲液=1：1比例加入样品缓冲液，煮沸5分钟，冷却后加样
7．连接好电极线，使负极上，正极下。稳压100v，电泳2～3小时
8．电泳结束，取下胶，刮掉浓缩胶后，染色40分钟
9．脱色24小时
10．干胶
【注意事项】
1．30%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护
2．过硫酸铵需现用现配
3．过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可
4．用微量加样器上样时，勿刺破胶面
【教学内容四】
总结
1．总结人血清α1-抗胰蛋白酶（α1－AT）分离及鉴定的原理和流程
2．整理、计算和分析实验数据
3．以科研论文形式提交实验报告
4．根据本实验所学知识，自行设计豌豆凝集素的分离纯化实验
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