【教学内容二】
DEAE-纤维素离子交换层析(离子交换层析概念, 交换剂的组成，分类, 交换剂的选择，离子交换层析基本原理, 分离α1-AT原理及操作过程, 注意事项, 洗脱方式及意义)。酶活性测定，蛋白质定量
【原理】
1. DEAE-cellulose离子交换层析：
DEAE-cellulose是应用最广的阴离子交换剂，本身带有正电荷，能不同程度的吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同离子强度或不同pH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的离子首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。
2. α1－AT活力测定：
α1－AT的活力是通过检测它对胰蛋白酶的抑制力而测定的。胰蛋白酶可以水解低分子底物—苯甲酰精氨酰对硝基苯胺，产生黄色产物对硝基苯胺，颜色深浅与胰蛋白酶活力成正比。将各步纯化的α1-AT样品与一定量的胰蛋白酶溶液反应，检测胰蛋白酶剩余活力，该剩余活力与α1-AT活力成负相关。
【仪器】
1．722分光光度计
2．恒温水浴
【试剂】
1．DEAE-纤维素
2．样品：由G-25除盐的α1-AT粗提液
3．0.05mol/L pH6.4磷酸缓冲液；0.12mol/L pH6.4磷酸缓冲液
4．0.5mol/L NaCl
5．0.5mol/L HCl
6．胰蛋白酶液：取3mg胰蛋白酶溶解于16.6ml pH3水中，浓度为180μg/ml
7．0.05mol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液，内含0.02mol/LCaCl2
8．苯甲酰－精氨酰－对硝基苯胺（简称BAPNA）, 取18mg BAPNA溶解于10ml甲醇中, 加Tris-HCl缓冲液到50ml
9．33 %乙酸
【步骤】
一 DEAE-cellulose离子交换层析
1. 观看教学录像
2. 取出上次课的粗提样品，低温解冻
3. 装柱（方法同凝胶过滤层析），用0.05mol/L pH6.4磷酸盐缓冲液平衡
4. 加样及洗脱，流速15滴/分。
5. 用双缩脲试剂检测洗脱液，出现红色，为第一蛋白峰，不收集，继续检测直至洗脱液无蛋白质
6. 换0.12mol/L pH6.4磷酸缓冲液继续洗脱，待第二次出现红色，为第二蛋白峰，收集，直至红色消失。量取体积，记录，放4℃冰箱待用（标记为DEAE样品）。
二 α1－AT活力测定
