取6ml醛化酶加20mg抗体球蛋白（用2ml碳酸盐缓冲液溶解），混匀，室温搅拌2-3小时后加10mg硼氢酸钠盐，4℃冰箱4小时或过夜。次日取出加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物(去游离酶)，并用50%饱和硫酸铵洗涤1-2次。再溶于3ml PH 7.4 PBS中，并置透析袋经透析除盐，如有沉淀藉离心除去。上清酶结合物加入等量60%甘油PBS，分装保存，冰箱备用。
如采用改良过碘酸钠简化法制备酶结合物，比原法更简便、快速，所获制品质量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸钠或水溶解，充分混匀，约5分钟后加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内20分钟，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇（AR）沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇（尽量去除乙醇），沉淀用PH9.6的0.05 mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊或马抗人IgG（内含蛋白量20mg左右），搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mg NaBH4 混匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50%饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理盐水透析除盐（需换液5次），如有沉淀藉离心除去，上清呈淡棕色即为酶结合物。加60%甘油PBS，分装保存备用。
制备好的酶结合物，要作两者克分子比和使用稀释度的测定，标记率的测定(A403/A280—0.4—1.0为宜)。
1、酶结合物克分子比测定：将制备好的酶结合物经适当稀释在分光光度计中以280nm和403nm测O.D值，然后按下列公式计算两者的克分子比。
（1）酶戊二醛交联法的计算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4为酶O.D403nm=1.0时相当于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42为酶蛋白结合戊二醛后在280nm应有的O.D，抗体球蛋白0.62为蛋白质与酶--戊二醛结合后O.D280nm值约应以加6%，故以0.94校正之。换算系数，故最后要乘于0.62。
(2）用过碘酸纳氧化法的计算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3为酶蛋白本身在280nm应有的O.D值。
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶结合物的克分子比。
一般要求制备好的酶结合物二者克分子比在0.8-1.2，但不能超过2或稍高。
2、酶结合物使用稀释度测定：先将一定浓度的抗原（如为抗人酶结合物，则用1μg/ml正常人IgG）包被固相载体，洗涤后加一系列不同稀释度之酶结合物进行孵育，洗涤加底物显色，并终止反应。在酶标比色计中测定不同稀释度酶结合物的O.D值，选择O.D值≥1.0的那个酶结合物稀释度即为本批酶结合物的使用浓度，见表中约1：12000稀释。
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酶结合物稀释度 |
1：3000 |
1：6000 |
1：9000 |
1：12000 |
1：15000 |
1：18000 |
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O.D值 |
2.45 |
1.96 |
1.59 |
1.12 |
0.74 |
0.405 |
（五）洗涤剂与稀释剂：为了使特异性结合的抗体量尽可能多，包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处,增加本底颜色,产生假阳性反应,这是限制ELISA特异性的一个因素.因此不少学者在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。已经证明牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20有良好的封阻作用。其加入的量BSA为0.5%～1%；吐温—20为0.05%。（有人曾经比较了四种洗涤剂，结果认为蒸馏水加0.05%吐温-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐温-20都是良好的）。在一般的洗涤剂和稀释剂中还加有NaN3防腐，但是用HRP制备酶结合物时则不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗涤剂或稀释剂中虽可改善ELISA的结果观察，但由于BSA比较昂贵，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗涤剂中加入0.1%白明胶，2%免血清，有利于加强封阻作用。最近有人报告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl缓冲液中加入0.05%吐温-20作洗涤剂，效果很好，被检血清和酶结合物的稀释剂，可与洗涤剂相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀释剂和洗涤剂中所加的吐温-20很重要。它不仅能消除非特异性的本底反应，而且还可增加阳性标本的敏感度，这可能与吐温-20能分离所吸附的非特异性物质有关。目前采用的洗涤剂为PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐温-20，如无吐温-20，也可用吐温故-40或吐温-60代替。但吐温-80本底较高，不宜应用。（0.5 mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀释剂中，可提高特异性。
