由于HRP中的酶蛋白和铁卟啉分别在波长280nm和403nm有二个最大吸收峰，其两者的比值，即O.D403nm/O.D280nm称为RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而来，表示酶的纯度。高纯度酶制品RZ值可达3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高达75%。不适合作ELISA用，经纯化后才能应用。目前我们国产的HRP RZ值达2.5-3.0，亦可作ELISA用。
抗体：制备酶结合物的抗体最好要提纯。被标记的抗体要求效价及亲和力都要高，因为纯化抗体可增加反应的特异性。如果采用级特异性的酶结合物（例如酶标抗IgM、酶标抗IgG）。有助于区别活动性感染（早期诊断）和已过性感染（追朔诊断）。但在大多数情况下，用抗血清中的全球蛋白成份与酶结合所制成的结合物亦可应用，而且相当稳定。其方法是用硫酸铵沉淀抗血清三次（50%饱和的1次，33%饱和的2次），经透析除盐，即可用于标记。或者经DEAE-纤维素柱层析后所制成的IgG亦可标记。如将IgG再通过葡聚糖凝胶G-200胶滤（用PH7.2 PBS洗脱）所得纯化IgG用HRP标记则更佳。但损失较大，也有人用亲和层析法提纯抗体来标记的。但在用酶来标记抗体前，需测定一下抗体球蛋白效价和蛋白含量。一般用Beutner氏琼脂糖散法测效价（即玻片双相琼脂扩散法），中央孔加1mg/ml抗原，周围孔加不同稀释度粗制或提纯抗体（马或羊抗人IgG），室温扩散24小时，沉淀反应效价达到1：16以上者即可应用。而蛋白质含量可用751紫外线分光光度计测定，也可用Folin酚法测定。
结合：用什么样的方法将HRP与抗体球蛋白结合起来呢？当然不能用强烈的方法，因为强烈的方法会使酶和抗体失去活性。故只能用温和的方法把酶和抗体结合起来。因此，必须使用结合剂。理想的结合剂应具备下列条件：（1）不影响酶及抗体活性，（2）不产生干扰物质，（3）抗体和酶结合后应有较高的产量，（4）不出现非特异性反应,(5)结合程序简便，（6）来源易、价廉。目前常用的有戊二醛和过碘酸钠二种。由于对所使用结合剂的针对性，因此标记的方法也有戊二醛交联法和过碘酸钠氧化法两类。
1、戊二醛交联法：戊二醛是一种能使蛋白质与蛋白质联结最常用的双功能试剂。它有2个对称的活性醛基，可分别与酶蛋白和免疫球蛋白上的游离氨基（酚基、味唑基、巯基）以共价键边接起来而形成的酶结合物。例如酶（Fe-E-NH2CH2OH，）通过戊二醛与免疫球蛋白（Ig-NH2）的交联反应式如下：
用戊二醛标记又可分为一步法和二步法。一步法主要是将酶、抗体球蛋白和戊二醛同时混合而直接制备。此法虽然简单，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，当然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶标记抗体的比例较少，同时抗体和酶的活性丧失较多，结合物的酶活性较低，但较简便。戊二醛二步法中先用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的一个活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合后，除去过量戊二醛（可通过葡聚糖凝胶G-25过柱或用透析法除去），然后，再加入抗体球蛋白，使之与酶--戊二醛复合物反应，形成酶结合物。而酶结合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如赖氨酸除去，于稳定酶结合物的特异性。在戊二醛二步法中，酶本身并不产生缩合，因为在第二步酶分子上的一个游离氨基仅与戊二醛上的一个活性醛基联结，而戊二醛上另一个活性醛基则可与第二步加入的抗体球蛋白分子上的氨基结合生成酶结合物，因此，两步法优点是能生成均一的酶结合物，大多可使一个分子酶与一个分子球蛋白作用，抗体和酶的活性损失较少，所得酶结合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是将10mg HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L PBS中，置室温18小时，充分透析或经葡聚糖凝胶G-25层析除去多余戊二醛，加生理盐水至1ml，然后加入5mg纯化的抗体球蛋白及0.1ml PH 9.6的1 mol/L碳酸盐缓冲液，混合后于4℃冰箱放置24小时，加入0.1ml 0.2 mol/L的赖氨酸溶液，室温置2小时，用PH 7.2、0.15 mol/L PBS充分透析，藉离心除去沉淀，上清即为酶结合物。必要时可作进一步纯化后使用。
2、过碘酸钠氧化法：本法是目前酶标记抗体较好的方法，能使70%酶与90%以上球蛋白结合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，FDNB）封闭HRP表面的游离氨基（亦可用甲醛或戊二醛来封闭），从而提高酶结合抗体球蛋白的能力，避免酶的自身交联。然后用过碘酸钠来氧化HRP表面结构的醣链部份（即低聚醣基团）使成醛基，使其直接与抗体球蛋白上的游离氨基形成共价键而结合。最后用硼氢酸钠还原，使HRP表面醛基能充分与抗体球蛋白上氨基进行反应，使之形成稳定的结合物。其反应式如下:
其标记步骤是：10mg HRP溶于新鲜配制的0.3 mol/L PH 8.1碳酸氢钠2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯无水乙醇溶液，室温中搅拌1小时以封闭HRP表面的游离氨基。再加2ml 0.08 mol/L NaIO4水溶液，于室温中轻搅30分钟，用0.16 mol/L乙二醇溶液终止氧化反应。1小时后移入透析袋中置0.01 mol/L PH 9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，除去试剂，透析袋中的即为醛化酶。
