(1) 酶标抗体法
¨ 通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。
– 优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。
– 缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。
(1) 酶标抗体法——直接法
¨ 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。
(1) 酶标抗体法——间接法
¨ 将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。
酶标抗体间接法的操作步骤
¨ 标本准备：
– 石蜡脱蜡至水；
– 冰冻切片浸入4°C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；
– 细胞爬片先用PBS洗，然后4°C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；
¨ 石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；
(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)
¨ 封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min (湿盒内) ；
¨ 0.01M PBST漂洗，5min×3；
¨ 5～10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭，室温孵育30min (湿盒内) ；
¨ 倾去血清勿洗，加1％BSA(PBST配制)稀释的一抗， 37°C孵育60min 或4°C过夜(湿盒内)；
(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)
¨ 0.01M PBST漂洗，5min×3；
¨ 加HRP标记的二抗室温孵育lh或37℃30min ；
¨ 加0.01％H2O2~0.05％DAB显色 (显色液应新鲜配置)；
¨ 经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。
(2) 非标记抗体酶法——酶桥法
¨ 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；
¨ 以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；
¨ 再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布
– 优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。
几点说明
¨ 一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。
¨ 二抗——桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。
¨ 因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。
(2) 非标记抗体酶法——PAP法
¨ 与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替;
¨ PAP是离体制备的复合物(HRP--抗HRP)。
¨ 显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。
PAP法评价
¨ PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。
– 缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。
¨ 由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。
(三) 亲和组织化学法
¨ 是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。
¨ 这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。
生物素—抗生物素染色法
【原理】
¨ 生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。
¨ 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。
¨ 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。
– 该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。
(1)标记抗生物素—生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分为直接法和间接法。
¨ 直接法
用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。
¨ 间接法
用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一抗体相连结，最后进行呈色反应。
(2)桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB)
– 此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。
(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法
(ABC法)
¨ ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。
¨ ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。
¨ 分为直接法和间接法。
– 直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合；
– 间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。
ABC法的评价
¨ 敏感性强：ABC法比PAP法敏感性高20~40倍。
¨ 特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非特异染色。
¨ 方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。
¨ 由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。
