(一) 免疫荧光法
【原理】
¨ 用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
¨ 荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
¨ 借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
¨ (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
¨ (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
¨ (3) 四乙基罗丹明 (RB200)
¨ (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)
¨ 易溶于水和乙醇。
¨ 最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量 389.4。
¨ 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
¨ 最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
¨ 与蛋白质结合的方式同FITC。
(3) 四乙基罗丹明(RB200)
¨ 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
¨ 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。
¨ RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸e-氨基反应而标记在蛋白分子上。
(4) 碘化丙啶(PI)
¨ 是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
¨ PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
¨ 最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
¨ 一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
– 一般认为0～4°C可保存1～2年，-20°C可保存3～4年。
– 要小量分装，防止反复冻融。
– 保存前需加防腐剂 (浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠) 。
3、免疫荧光的染色方法
¨ 免疫荧光染色法常用的有
– 直接法
– 间接法
j原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。
k直接免疫荧光法的操作步骤
¨ 标本的处理：
– 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次；
– 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；
¨ 2%BSA或10%BSA37℃湿盒内封闭30min
¨ 抗体染色：
– 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37℃孵育30min；
k直接免疫荧光法的操作步骤(续)
¨ 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
¨ 缓冲甘油封片
– 分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
¨ 镜检：在荧光显微镜下观察。
¨ 优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
¨ 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
m直接免疫荧光法的注意事项
¨ 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
¨ 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
m直接免疫荧光法的注意事项 (续)
¨ 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
– 染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
– 染色温度：多采用室温(25℃)，高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
– 低温染色过夜较37 ℃ 30 min效果好的多。
m直接免疫荧光法的注意事项 (续)
¨ 试验时需设置下列对照：
– 自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
– 阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
– 特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
¨ 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
