(3) 其它固定剂
¨ 丙酮：
– 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
¨ 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
– 抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
– 蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
¨ 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
¨ 化学方法
¨ 加热方法
– 水浴加热法
– 微波照射法
– 高压加热法
– 酸水解法
(1) 化学方法
¨ 主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
– 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37℃，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；
– 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37℃、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。
• 例如：Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加热法
¨ 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
– 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，
– 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
(3) 微波照射法
¨ 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
¨ 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。
(4) 高压加热法暴露抗原
¨ 将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。
¨ 由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。
(1) 酸水解法
¨ 酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
¨ 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。
¨ 此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
¨ 达到规定的温度(92～95°C以上)；
¨ 维持一定的时间；
¨ 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；
¨ 加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；
¨ 修复液：
– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；
– 最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。
4、载玻片的处理
¨ 抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。
– 新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。
¨ 常用的粘附剂有：
– APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
– Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）
– 铬明胶溶液
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
¨ 现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);
¨ 将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；
¨ 取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60℃烤箱烤干。
Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)
¨ 将清洁玻片浸于100mg/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37°C放置30min，然后60℃烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。
