具体操作程序:
在编号试管中分别加冷PBS 50 µl,加入鼠抗人红细胞CR1(CD35)单抗1.5 µl及待测枸橼酸钠抗凝新鲜血0.5 µl,充分吹打混匀,置室温下避光30 min。加入PBS液2 ml,1500 r/min 离心5 min,弃上清液;加入荧光素标记的第二抗体 — 羊抗鼠IgG-FITC 1 µl,吹打混匀,置室温下避光30 min;再加入PBS液2 ml,充分混匀、洗涤,1500 r/min 离心5 min,弃去上清夜后加入PBS 300 µl,混匀后置流式测试管中,严格按照流式细胞仪操作程序测定样品和对照品,在计算机屏幕上显示或记录各待测标本红细胞平均荧光强度。
5 正常红细胞与异常红细胞毛细管电泳分离
能直接反映颗粒电性质的毛细管电泳具有高效、简便、灵敏度高、样品消耗少等优点,在生化领域已经广泛应用于蛋白质及其衍生物、肽类、氨基酸、糖类物质、无机离子、手性物质等的分离与分析。
运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染的异常红细胞进行比较,以此来反映鉴定不同状态的细胞。
样品制备
1) 正常红细胞悬浮液
用含6%葡萄糖的0.1mol/L, pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释红细胞,通过血球板计数法,确定细胞浓度为1.86×107个/ mL。
2) 异常红细胞悬浮液
取上述浓度红细胞0.2 mL与H1N1甲亚型流感病毒0.02 mL充分混合,常温(25℃)下反应1h。
电泳条件
每天运行前用0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH、水、缓冲液分别洗柱3、6、3、3 min;每轮运行前均用0.1 mol/L NaOH 、水、缓冲液分别洗柱3、1、1 min;结束实验时用0.1 mol/L HCl 、 0.1 mol/L NaOH和水分别洗柱5、10、5 min,最后将毛细管内壁吹干保存。正极进样,负极检测,均在室温下进行。进样压力3.448 kPa,进样时间5 s;分离电压20 kV;紫外检测波长214 nm;分离温度25℃。
感染病毒后,在病毒作用下红细胞表面荷电量会发生改变,致使细胞电泳速度和zeta电位发生改变。实验证明,被病毒感染的红细胞与正常的红细胞的出峰时间有明显的差别(被病毒感染的红细胞出峰时间要比正常的红细胞出峰时间晚),且峰形有了显著的变化。
细胞的电泳行为与细胞表面的电荷量直接相关,而细胞表面的电荷量是由细胞膜上的生物大分子的化学基团的离子化和表面吸附的离子决定的,病变的细胞其表面成分发生改变,其带电性也有所改变,因此通过检测细胞的电泳行为,了解细胞损伤程度,有助于预测疾病的发生。


