6. APAAP法
（1）冰冻切片或细胞涂片用PBS浸泡3分钟，石蜡切片常规脱蜡后胰酶消化，PBS洗3次。
（2）正常羊血清（1：10——50）室温20分钟。
（3）适当稀释的特异性抗体，37℃60分钟，或4℃过夜。
（4）PBS洗3次。
（5）桥抗体（如羊抗鼠或羊抗兔IgG1：100——200），37℃40分钟或室温1小时。
（6）PBS洗3次。
（7）滴加适当稀释的APAAP复合物，37℃30分钟。
（8）PBS洗3次。
（9）滴加（或浸入）AKP底物溶液，37℃15——30分钟，阳性结果显现清晰后流水冲洗。
（10）复染（核固红或苏木素或甲基绿）1——2分钟，常规冲洗后，甘油明胶封片。
7.注意事项
（1）免疫酶最适宜进行石蜡切片的染色，为回顾性研究创造了条件。对保存时间较久的石蜡标本或在制作石蜡块的过程中抗原成分丢失或被封闭的组织，酶的消化是非常重要的。应根据组织及抗原的情况选择适当的胰酶浓度进行消化。最常用的为0.1~0.5％胰蛋白酶和0.4％的胃蛋白酶.
（2）除直接法，特别是酶桥法和双PAP法，由于步骤较多，每步骤间的冲洗就显得非常重要，常常是导致染色失败或结果不理想的主要原因。
（3）各级抗体的稀释度是染色成败的关键。一般而言，特异性一抗的稀释度应尽可能高，桥抗体的浓度要足够，酶标抗体或抗酶抗体的稀释度要适中。
（4）用HRP作为标记酶，要注意封闭内源性的HRP的干扰，若封闭效果不理想，也可以将H2O2甲醇作用于切片的步骤移至特异性的抗体孵育之后进行，或两次封闭，即切片消化之后和加桥抗体之前。
三、免疫金银法
1. 免疫金法（IGS）
（1）切片常规脱蜡入水。
（2）0.05M TBS PH7.4 洗10分钟。
（3）1％卵蛋白作用切片15分钟。
（4）滴加特异性一抗，室温2小时后4℃过夜。
（5）0.5M TBS PH7.4洗3次。
（6）0.02M TBS PH7.4(内含0.1％牛血清白蛋白)5分钟.
（7）1％ 孵蛋白作用切片15分钟。
（8）胶体金标记SPA（萄萄球菌A蛋白，详见亲和免疫细胞化学技术一章）室温孵育1~2小时。
（9）0.02M TBS PH7.4洗3次。
（10）双蒸水洗2次。
（11）1％戌二醛10分钟。
（12）双蒸水洗3次。
（13）复染、封片、观察。
结果：胶体金结合部位呈鲜樱红色。
2．免疫金银法
（1）切片常规脱蜡入水。
（2）经含汞固定液固定的组织切片需经0.5％碘酒精脱汞,然后入0.5％硫代硫酸纳水溶液脱碘,再用流水冲洗10分钟,蒸馏水洗后入0.05M TBS PH7.4液冲洗.
（3）抗原性较弱的组织切片，需经0.1％胰蛋白酶液消化，37℃ 30分钟，抗原性较强的组织可免去此步骤。
（4）正常羊血清（1：5或1：10）作用10分钟，吸去，不洗涤。
（5）滴加适当稀释的特异性抗体37℃ 30—60分钟或4℃过夜，室温复温2小时。
（6）0.05M TBS PH7.4 液洗3次。
（7）0.02M TBS PH7.2 液洗3次。
（8）正常羊血清（1：5）10分钟，吸去，不洗涤。
（9）滴加适当稀释的金标记抗体（如金标记羊抗兔IgG抗体，此时特异性抗体为兔源性）室温下1小时后4℃过夜。
（10）0.02M TBS PH8.2液洗3次。
（11）0.05M TBS PH7.2 液洗3次。
（12）蒸馏水洗2次，双蒸水洗2次。
（13）入银显影液中3—5分钟或阿拉伯胶银液中20—40分钟，反应过程需避光。
（14）蒸馏水洗。
（15）自来水冲洗，苏木素淡复染。
（16）脱水、透明、封片、观察。
结果：特异性抗体结合部位呈灰黑色颗粒，背景呈清灰色，核呈淡蓝色。
3．注意事项
（1）染色过程中若用标记葡萄球A蛋白代替金标记间接抗体，需用1%卵蛋白处理切片。0.02M TBS均为 PH7.4。若用金标记间接抗体，则用正常羊血清处理切片，0.02MTBS应为PH8.2，要注意PH值变化时的良好过渡，不可直接由蒸馏水入PH8.2的TBS，应经PH7.4过渡。
（2）对不经含汞液固定的组织，若也经碘液的处理，有作者认为染色结果更为满意。
（3）切片入银显影液应避光，最好是在暗室内用红色安全灯监测染色反应强度。显影液用重蒸水配制反应速度很快，用阿拉伯胶配制则反应速度较慢，容易掌握。
