二、免疫酶法
免疫酶法的最大优势是特别适用于石蜡切片的染色，并且用一般光学显微镜就能观察，定位也较荧光显微镜下精确。
1.直接法
（1）组织切片常规脱蜡入水。
（2）胰酶或胃蛋白酶消化，37℃0.5—2小时。水洗。
（3）0.3％H2O2甲醇液（封闭内源性酶）10—15分钟。冰冻切片、细胞涂片从此步骤开始。
（4）水洗后经PBS洗1—2次。
（5）正常血清或牛血清白蛋白孵育15分钟。室温。
（6）甩掉覆盖在切片上的上述（5）血清，加酶标记抗体，37℃ 30分钟。置温盒内。
（7）PBS洗3次。
（8）显色。在酶的底物溶液中於显微镜下观察控制呈色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。
（9）自来水充分冲洗。
（10）需要时用Mayer’s苏木素复染胞核。
（11）封片。若用DAB等呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。若用AEC等则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。
（12）对照染色。直接法应有严格的对照染色。可设空白对照、阳性对照及抑制试验。（方法见前）。
2．间接法
（1）~（5）同直接法。
（6）甩掉正常血清滴加适当稀释度的特异性抗体，37℃，30—60分钟4℃过夜，置湿盒中。
（7）PBS洗3次。
（8）滴加适当稀释的酶标抗体（例如羊抗兔GHRP标记抗体，此时特异性抗体应为兔源性的抗体）于标本上，室温或37℃30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）以后步骤同直接法。
3.酶桥法
（1）~（5）同直接法。
（6）滴加适当稀释的特异性抗体（如兔抗人IgG）4℃16—24小时。置湿盒中。
（7）PBS洗3次。
（8）加桥抗体（如羊抗兔IgG），用5％正常人血清稀释可消除交叉染色，室温或37℃30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）加兔抗酶抗体（如兔抗HRP抗体）37℃30分钟置湿盒中。
（11）PBS洗3次。
（12）加酶溶液（如HRP50—100ug/ml），室温30分钟置湿盒中。
（13）PBS洗3次，双蒸水洗1次。
（14）用酶底物显色（如DAB+过氧化氢），在显微镜下控制显色过程。余同直接法。
4.PAP法
（1）——（5）同直接法
（6）滴加适当稀释的特异性抗体（小鼠抗人IgG，即鼠单抗）37℃30——60分钟或4℃过夜，置湿盒中。
（7）PBS洗。
（8）加兔抗小鼠IgG抗体，37℃30分钟。
（9）PBS洗3次。
（10）加PAP抗体（鼠PAP抗体）37℃30——40分钟。
（11）PBS洗3次。
（12）同直接法。
5.双PAP法
（1）同PAP法（1）—（11）。
（2）重复第二抗体即兔抗小鼠IgG抗体，但稀释度是前次的一倍，37℃ 30分钟置湿盒中。
（3）PBS洗3次。
（4）重复PAP抗体即鼠PAP抗体，同样，稀释度也应比前次大一倍，37℃ 30分钟置湿盒中。
（5）PBS充分洗3次。
（6）同直接法。
