重铬酸钾(K2Cr2O7)
重铬酸钾为一种橘红色有毒性的块状结晶体,溶于水,不溶于酒精,为一种强氧化剂。所以其水溶液不应与酒精,福尔马林等还原剂相混合使用。在某些情况下,同福尔马林混合固定标本时,只能在使用前相混合,过久即失去固定作用。经重铬酸钾固定后的组织应及时进行水洗脱水,否则标本变硬脆化,不易制成切片。如不能当即制作切片,可将标本保存于福尔马林液内。
重铬酸钾对蛋白质的结合作用像福尔马林一样,固定胞浆不易引起沉淀作用。但在溶液中加入醋酸,PH为3.75时,会使染色质和细胞浆硬化,使之产生铬酸,才能使蛋白质呈网状沉淀。重铬酸钾对细胞质,染色质固定良好,但染色质则被溶解。未酸化的重铬酸钾虽不能沉淀蛋白质,但可使蛋白质变为不溶性,还可以保护磷脂类,亦能固定类脂物,使其不溶解于脂溶剂。因此,可以固定高尔基氏体和线粒体。
重铬酸钾不是糖的固定液,用重铬酸钾(或铬酸)固定的组织几乎完全不会发生收缩,但经酒精脱水时,则收缩明显。所以在脱水之前,组织需用流水冲洗16-12小时。如把含铬组织直接转移到酒精内,会形成一种非溶性低氧化物而不易除去。
重铬酸钾有溶解染色质的缺点,一般备用液为5%水溶液,固定液使用浓度为1%-3%水溶液。
铬酸(CrO3)
为暗红色或带暗紫色的块状结晶,具有强酸性及腐蚀性,剧毒,易潮解,为强氧化剂,应置于暗处。它是Orth氏液或ZenRer氏液等复合固定剂中的一种成分,不应同酒精、福尔马林等还原剂混合使用。铬酸与乙醇,乙醚少许接触即可引起爆炸。
铬酸可沉淀所有的蛋白质,使不溶于水,并可保存糖类。铬酸水解DNA系将其戊糖转变为一种醛;亦可将糖类转变为醛。因此DNA和糖类不需经过常规PAS或Feulgen反应的预先处理即与Schiff试剂呈阳性染色。
铬酸的渗透力较低,对标本收缩轻微,经铬酸固定剂固定的组织像用重铬酸钾固定一样需彻底水洗,将组织中铬酸全部洗去,否则在脱水过程中,铬酸与酒精作用生成氧化铬的沉淀,使组织脆化,且不易于组织的着色。铬酸适合固定的浓度为0.5%~1%。
四氧化锇(OsO4)
为微黄色结晶,通常密装于安瓿内出售,为强氧化剂,一般认为它使未饱和键氧化。对饱和脂肪不起反应,未饱和脂类可还原OsO4,易氧化为黑色氢氧化物,溶液呈中性,挥发性强,在操作四氧化锇时应小心,因其气体有刺激性,会引起结膜炎。遇热和光时易还原,故应贮于冷暗处。平时溶液密闭有色瓶中,并置于冰箱内。
四氧化锇是脂肪和类脂质的固定液,用以显示脂类(例如髓脂类)。能使单个细胞或小组织的微细构造得以极好地保存,因此几乎是用于电子显微术最佳固定剂。组织经固定后,脂肪,类脂呈黑色,微溶于二甲苯及酒精,脱水后最好以苯作透明剂。
四氧化锇的渗透力弱。组织块如过2-3厘米厚度则穿透不良和不均。所有含四氧化锇固定剂的固定作用皆很不均匀;固定不良的组织切片表现周围有一圈过度固定的暗色区带;中心为固定不足致使细胞微细结构不清的区域。有些成分变暗是由于无色的OsO4转变为黑色水合物OsO4·5H2O形式。
四氧化锇常与铬酸,醋酸,重铬酸钾等混合使用,固定后的组织需经流水冲洗,否则在脱水酒精中易被还原产生沉淀,不利于核着色,在每10毫升溶液中内加入1滴饱和氯化汞水溶液有助于制止还原作用。
氯化汞(又名升汞或二氯化汞HgCL2)
氯化汞为白色粉末或针状结晶,后者为化学纯品,易升华,能溶于水和酒精。一般固定用其饱和溶液。
氯化汞是一种能迅速透入并使组织硬化的蛋白沉淀剂。通常像别的金属离子那样,它与蛋白质的酸基以及核蛋白的磷酸基相结合,亦特异地与氢硫基起反应。因而经Hg固定后的蛋白质不溶于水,大多数蛋白反应可被利用。可惜,它的透入速度于最初几毫米后就急骤降低,因此组织块厚度如超过5毫米常使外围过度固定致坚硬而中心固定不足仍柔软,只宜固定薄片组织。由于此缺点加之使组织收缩剧烈,很少单独使用;当与拮抗此缺点的试剂如醋酸,福尔马林,重铬酸钾等结合使用时,氯化汞仍是很多优良常规固定剂的一种成分。用氯化汞固定的组织使染色特别对胞浆着色比较鲜丽。
凡用含氯化汞的固定剂固定的组织如超过规定时间会使组织过度硬化,而难切薄片。组织内常存有汞盐,切片时能损伤切片刀,所以在脱水前应予以洗去。常用方法是用70%酒精加入少量碘(0.5%)浸洗,再进行充分的冲洗或以70%酒精洗后进行脱水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗数分钟,再以5%硫代硫酸钠漂洗,水洗后进行染色。
氯化汞常备溶液为饱和(约7%)水溶液,固定用浓度常为5%水溶液。用升汞饱和液固定组织时,临时须加5%冰醋酸。固定2-3mm厚的组织块须经6-18小时,然后用水洗24小时,再保存于80%酒精中。
氯化汞腐蚀金属,混有此试剂的固定液不能使用金属容器盛装或用金属镊子夹持。氯化汞有剧毒,应妥善保管。


