（四）操作方法
1．取样品离心后（1 000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。
2．另加入80µl免疫反应试剂 含抗－DNA－POD、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1︰1︰18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。
3．取上清，用300µl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。
4．加入100µl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。
5．尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。
（五）结果判定
按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：
注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若样品的吸
收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。
三、原位末端转移酶标记技术
（一）原理
凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。
（二）荧光标记法
1．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor公司ApopTagTM试剂盒，包括：
⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)１nmol/µl
⑵ TdT酶（25U/μl）
⑶ 反应缓冲液
⑷ 洗涤缓冲液
⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5µg/ml）或抗地高辛抗体（1︰30）
⑹ PI染液（含PI 5µg/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）
⑺ PBS缓冲液
⑻ 塑料盖玻片
2.样品
⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
⑵ 贴壁生长的培养细胞
⑶ 冰冻切片
⑷ 常规石蜡切片
3.操作方法
（1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。
（2）洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min,三次。
（3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶0.5μl,标记的-dUTP 1μl）,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h。
