1．病毒株 牛流行热（BEF）北京毒株。
2．实验动物 无牛流行热的小公犊牛、健康雄性家兔。
3．被检血清。
（二）操作方法
1．特异性阳性血清的制备 以BEF强毒脱纤血给小公犊牛静脉接种10ml，出现典型症状后两周，以同样剂量做第二次接种，以后每隔一周接种一次，共5～6次，剂量分别为15ml、20ml、25ml、35ml，末次接种后2周采血清样品测效价，效价达1︰128以上时即可放血收集血清，-20℃保存。
1． 荧光抗体的制备与鉴定
（1）健康牛血清IgG的提取 取牛血清以30%饱和（NH4）2SO4提取3次，然后以少量PBS溶解沉淀，4℃透析18h，过G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS液洗脱，收集洗脱液，再透析18h，以0.01Mol/L pH7.2PBS平衡4h，离心去沉淀，过DEAE纤维素柱，收集IgG，测其蛋白含量和纯度。
（2）兔抗牛血清IgG高免血清的制备 取健康家兔数只，免疫前一周分别于足掌部接种卡介苗1ml（含2mg）两侧各接种0.5ml。
琼扩法测血清抗体效价1︰64~1︰128为合格。
（3）兔抗牛IgG高免血清IgG的制备 同提纯健康牛血清IgG法。
（4）荧光抗体的标记及鉴定 按兔抗牛血清IgG量的1/50称取异硫氰酸荧光黄，将荧光素溶于IgG溶液总量的1/10体积的0.5Mol/L pH9.6碳酸缓冲液中，再缓慢滴加在磁力搅拌器下的IgG溶液中，于18℃～20℃搅拌3h，然后将荧光抗体结合物立即通过葡聚糖凝胶G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS洗脱，收集第一峰，求出F/P比值，以F/P值为2左右（各批平均比值）合格。
将荧光抗体分装于安瓶中、封口、并置 -40℃保存。
3．抗原标本片的制备 将BEF病毒接种于BHK21细胞，当CPE达70%～90%以上时，将细胞刮取下来，以1 000r/min离心5min，去上清，加入灭菌盐水，再离心5min，以沉淀的染毒细胞作抗原标本涂片，自然干燥后，丙酮（室温）固定10min，PBS液洗一次，再用去离子水洗一次，吹干，即可染色，不染色的抗原标本置4℃保存。以同样方法把未接毒的细胞制成抗原对照标本片。
4．染色方法 取制备的抗原标本片及对照标本片，将经生理盐水作10倍稀释的特异性阳性血清、阴性血清分别滴加在抗原标本和对照标本上，置湿盒37℃温育30min～45min。以0.01Mol/L pH7.2PBS洗3次，每次3min，再用无离子水冲洗一次，吹干。以0.2%伊文斯兰稀释成1︰16～1︰32的荧光抗体滴加于抗原标本上，置湿盒37℃温育30min～45min，然后按上法处理吹干，以碳酸缓冲甘油封表。
（三） 结果判定
于荧光显微镜下观察，阳性结果：细胞膜呈明亮的黄绿色荧光，细胞核呈棕褐色，背景呈暗褐色；阴性结果：不出现荧光。
