（三）试验方法
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定（见表1－10）。
表1－10 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
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层析柱规格 |
凝胶的规格和用量（g） | |||||
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直径（cm） |
高（cm） |
容量（ml） |
G25 |
G50 |
G100 |
G200 |
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0.9 |
15 |
9.5 |
2.5 |
1 |
0.6 |
0.3 |
|
0.9 |
30 |
19 |
5 |
2 |
1.2 |
0.6 |
|
0.9 |
60 |
38 |
10 |
4 |
2.5 |
1.2 |
|
1.6 |
20 |
40 |
10 |
4 |
2.5 |
1.2 |
|
1.6 |
40 |
80 |
20 |
8 |
5.0 |
2.4 |
|
1.6 |
70 |
140 |
35 |
14 |
9.0 |
4.4 |
|
1.6 |
100 |
200 |
50 |
20 |
12.5 |
6 |
|
2.6 |
40 |
210 |
50 |
20 |
12 |
7 |
|
2.6 |
70 |
370 |
90 |
35 |
20 |
12 |
|
2.6 2.6 |
100 60 |
530 1 000 |
130 250 |
50 110 |
30 70 |
17 35 |
3．装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
装柱过程基本同离子交换层析柱。
4．加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脱液收集 同离子交换层析。
6．凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。
⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。
