［摘要］目的：探讨HBV未分离成功的情况下研究HBV父儿传播途径的可行方法。方法：以巢式PCR检测HBV DNA与序列分析的方法比较父亲与胎儿所携HBV S区nt451～660段，C区nt2022～2321段序列的一致性。结果：父儿间两段序列同源性在98%～100%之间。S区检出491、494、530、546、581位变异致使113、114、126、131、143位氨基酸替代。结论：巢式PCR与序列分析方法是目前病原体未分离成功的情况下研究传播途径的可行方法。
［关键词］乙型肝炎病毒；巢式PCR；序列分析；传播途径
［中图分类号］R512.6＋2 ［文献标识码］A ［文章编号］1003-8507(2000)04-0473-03
IDENTIFICATION OF THE PATHWAY OF TRANSMISSION OF HEPATITIS B VIRUS BY DIRECT DNA SEQUENCE ANALYSIS AND NEST PCR
PENG Gui-fu,WANG Shan-shan,JIANG Pu-lin,et al.
(Institute of Military Medicine,Guangzhou Command PLA,Guangzhou 510507.)
Abstract:Objective:To study the pathway of transmission of HBV from father to fetus under the condition that HBV cant be cultured.Methods:The consistence of S gene nt451～660 nucleotide,C gene nt2022～2321 nucleotide of father and foetus were compared by nest PCR and DNA sequence analysis.Results:The homology of HBV sequence between father and foetus was very high.The mutations of 491、494、530、546、581 nucleotide in the S gene caused substitutions of 113、114、126、131、143 amino acid.Conclusion:The nest PCR and DNA sequence analysis are useful methods in studying the pathway of transmission road when HBV can’t be cultured.
Key words:HBV;Nest PCR;Sequence analysis;Pathway of transmission
乙型肝炎病毒(HBV)的父婴传播已讨论多年［1，2］，由于HBV至今不能分离培养，研究传播仍有一定困难。本研究以巢式多聚酶链反应(PCR)与序列分析的方法研究父儿所携HBV在分子病毒学方面的特点，试图从分子水平证明HBV父儿传播的可能，并探索在病原体未分离成功的情况下研究传播的可行方法。
1 材料与方法
1.1 研究对象 从1995年3月至1996年3月在湖南省某县以HBsAg为指标筛检前来终止妊娠的孕妇及其配偶。选择8名男性HBV携带者与其子宫内受染有胎儿为研究对象。携带者以ELISA检测常规五项HBV血清学标志与PCR检测HBV DNA确定。均无既往肝炎史，谷丙转氨酶正常，无乙肝疫苗注射史，年龄在25～35岁之间。8名配偶以上述方法检测均无HBV感染，年龄在23～33岁之间。夫妇双方血清、白细胞、精液在住院期间收集。取终止妊娠3月以上胎儿。胎儿血在产出当时采取并分离血清保存于－20℃，同时分离白细胞。无菌条件下取肝脏组织。胎儿血清、白细胞、肝脏任何一项HBV DNA阳性者判定为子宫内感染。另外选择5对无HBV标志的夫妇与胎儿为对照。
1.2 检测方法
1.2.1 ELISA检测HBV五项血清学标志：HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc。
1.2.2 各种标本的处理及DNA的抽提 抗凝血液标本以白细胞分离液分离白细胞并PBS反复洗涤以除去血液中HBV DNA的影响，恢复体积分小包装低温保存备用；肝脏标本取2g与PBS2ml在无菌研磨器中研磨成匀浆PBS反复洗涤后加PBS2ml后分小包装低温保存备用；精液标本收集后离心将精子与精浆分开，精子以PBS反复洗涤以除去精浆中HBV DNA的影响，以PBS恢复体积分小包装低温保存备用。上述标本末次洗液PCR检测HBV DNA均阴性，各种标本按常规以苯酚、氯仿、异戊醇法提取DNA［3］。
1.2.3 PCR技术检测HBV DNA 引物合成于中科院上海细胞所。S区与C区各设计一对套式PCR引物(表1)。第一轮PCR产物1∶50稀释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。常规PCR方法参考文献［3］。
1.2.4 序列分析 取S区与C区第二轮PCR产物，以醋酸胺与异丙醇纯化用Fmol DNA cycle sequencing system(promega公司)以双脱氧链末端终止法测序［3］。r-32P-ATP购自北京亚辉公司。放射自显影后读片。结果输入计算机用DNASIS软件处理并与发表的序列(genebank)比较。
生命科学实验中心
选择生物秀，我秀我精彩！ 设为首页
