4．PCR产物的污染问题在大规模的PCR过程中，最严重的问题是PCR产物污染，据我们经验总结，80％以上的污染是由于接触式污染，剩余的污染则包括气溶胶污染等环境造成的污染。对于PCR污染这个问题，本公司制订了严格的实验措施，具体包括使用滤芯抢头、所有PCR体系全部分装、PCR体系与各类模板严格分离、配置体系人员与接触PCR产物人员严格分离等一系列措施，同时在处理PCR管，eppendorf管时也规定了详细的操作过程。
5．关于质量控制问题在每板PCR过程中，我们会放入两个阴性对照和一个重复对照，以确认PCR的过程中不会产生污染和PCR的结果确实可信。
技术基本原理和实例
本公司采用的巢式PCR－RFLP分型技术，其基本原来是利用PCR引物的3’端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNP rs1321425（rs1321425－来自NCBI的refSNP数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是我们对SNP位点前的上游碱基进行改造，通过对序列的分析和PCR效果的计算，我们将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT
图a rs9309462CTCGGGCCGCGAGTCCAATTTATACAAAAA C/T GTTGTATTTTTAGCCCTGGGCTCTGTTTAGATGGCG CTCGGTGGAAACGG 
图brs4646642 GGGGCAGATGTTTGGGCCGGGAACAATTTTC/T
CAAGGTTGTAAAGCCAAATTATCATTTCATGTTATCCATTTCTTCAAAGC
图c 本改造方案的成功之处在与3’端碱基的改造，一般而言，如果PCR引物的近3’端的几个碱基不能与模板互补，其实验是不能成功的，事实也大致如此。但本公司所采用的方案确能成功的将3’端引物进行改造，即使是3’端最后一个碱基与模板不匹配，我们也能成功的进行改造。如SNP（rs10491482），在改造过程中，与SNP直接相邻的GAA被改成了TGC，形成了GTGCAC(ApaLI)，就有3’端最后一个碱基被成功改造，形成限制性内切酶识别序列。rs10491482AGGCAGCCATGGACAATTTGCCTTTTTATTCTACTTGGAA A/G CTCTGCTGATAAAGCTGTTT AAGGGGCTCAGGTGCTGACAGGCTGGGCACTGTCAGTATC 
图d 这里所展示的实例，往往改造2、3、4个碱基，事实上，本方案理论上可进行5个碱基的改造，从而人为构建一个识别位点，但从碱基的组合而言，需要改动如此多的碱基很少，而且PCR效率也不是很高，因此若非有特殊需要，一般不产生5个碱基的改动。
