1. 反应体系 25ul
Cocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul
cDNA 5 ul
2. Primer 浓度,需要摸索,从200nM到700nm等,设置不同浓度
3. 每个引物浓度,从well 1到12设置4个样本,阳性cDNA 1和2,NTC以及H2O,做triplicate
4. 若用ABI 7000 或7700, 所有的PCR 条件可设置成一致的,减少麻烦,当然,引物设计时就要考虑好,第一步除UNG,然后预变性,然后PCR循环,ABI采用二步法,退火延伸均60度,循环最多40
5.结果分析: 阳性1,2曲线,NTC的Ct值需大于阳性Ct值至少5到6个循环以上,H2O基本Ct值接近40
6,做Dissociation Curve,若好的引物,可见单一峰,若见两个峰,则他们的温度差值需在2度以上
7.AGAROSE凝胶电泳证实,目的基因的长度,是否单一条带,有无杂带,和第6步的结果对照,引物二聚体的量,基因组DNA有无扩增
8.选择合适的引物浓度
9.必须考虑cDNA的含量,有时所检测基因表达非常低
一般按上述步骤,都能做出,问题通常在于: 你的cDNA质量,所用试剂的质量(建议用进口,既然走到这一步,就省不了了),引物设计是否合理(序列,Tm值接近50或60度,等)
10.即便能所用引物能获得扩增,但是并不能证明就能使用,如果采用相对法比较,还要做efficiency curve,此法假定的E值是2,也就是说你的标准曲线斜率需要达到-3.3左右,但是实际并不一定如此.若扩增效率和内参不同,那只有重新设计引物,或者采用标准曲线法
REAL BORING PCR,看来还是需要做许多工作的
实在不行,如果有MONEY,那就用TAQMAN,买ABI的KIT,那些公司都优化好的,基本可以直接使用,何况SYBR GREEN I的特异性不如TAQMAN,而且如果摸了无数次都不能获得良好的结果,那些花掉的MONEY还不如买现成的,即省钱省时省力,不过就是丧失了从不断的失败痛苦中寻找成功的喜悦了
