引物设计
通常引物中至少有15个碱基与靶序列相互补，而靶序列的3'-末端可以与任何添 加序列发生错配，单个碱基错配除引物3'-末端处3-4个碱基外，其他地方都可引入。 在PCR产物之间提供重叠的添加序列至少要有15个碱基，当然越和越好，这样它将使 重叠的杂合分子稳定。
原初PCR(PrimaryPCRs)
如上所述，为了避免非理想突变，应该用尽可能多的模板DNA。但必须注意，带 有或不带有所需突变的PCR产物的量与起始模板的量成正比，而这些DNA又可带入随后 的重组PCR反应中。若可能的话，这个比率可以通过纯化“原初”PCR产物而教师到降 低。在达到“平台期”(Plateau)之前，用尽可能少的PCR徨来产生足够量的PCR产物 也是个好办法。
从PCR中除去过量的引物
为了得到理想的组合PCR产物，必须从原初PCR产物中除去重叠引物或“内侧”引 物，然后加入“外侧”引物。用Centricon100的选择性过滤可以很容易地分开PCR产 物和引物，具体操作如下:
1.在Centricon100贮样器(Reservour)上部，将10-50μl原初PCR终产物加到 2mlTE(10mMTris-HClpH8.0，0.1mMEDTA)中，用石蜡膜盖封，颠倒混匀。
2.1000g离心25分钟，先滤出引物。再用大于1000g的速度离心。超过1000g的离 心力会使部分产物透过滤膜。再加入2mlTE到Centricon100中，重复离心。
3.重新悬浮PCR产物(大约40μl)
此外，PCR产物也可以用凝胶电泳来纯经，它有除去原初靶DNA的优点。
重组PCR
将原初PCR产物混合后，重叠分子的生成及延伸将在PCR条件下发生。用尽可能多 的PCR产物，以限制DNA复制的倍增次数和减少非理想突变发生。如果可能的话，作为 一个阳性对照反应，应确证外侧引物确实从未突变的模板中扩增了DNA片段(如果打算 事先将不相关的旬结合起来是不可能的)
