由于PCR产物中突变多少是与已经发生突变DNA复制次数成正比的，因而最好采用 最少PCR循环制备出足够的DNA量。所以起始反应就需要尽可能多的模板。值笪注意的 是:理论上，在10次复制倍增和20次复制倍制之间产间错误掺入频率仅两倍之差，但 在实际扩增中，却是1000倍的差异。
在这方面开展了大量的工作及实验，建议用经过测序验证没有无用突变的PCR产 物进行克隆。对于较小的靶基因，非理想突变发生几率也较小。\par小结
在PCR技术的应用中，着重于使用直接休学修饰的PCR引物在扩增片段中导入所需 的变异。它是在DNA片段末端加入标记和/或新的序列的最简单途径。它也可在两个 PCR产物之间另创一个重叠序列而使它们很容易地进行重组。
在新的大分子研究中，重组PCR(将组合PCR片段的反应都归入这个名词下)是一个 具有潜力而有效的新方法。它能很容易地产生特异性的新DNA重组序列。重组DNA法还 大大地简化了检验由这些基因编码的新蛋白的工作。人们可以想象PCR产物可以直接 进行体外转录/翻译。若目的蛋白活性可以特异地、灵敏地进行检测，那么体外产生 的蛋白数量可能就足够用来检测所需的特性。最令人满意的PCR产物就可以高产率地 进行克隆和表达。
操作指南A:用添加内切酶位点来克隆PCR产物
限制性内切酶的隆解:
1.混匀25μlPCR反终产物，10μl合适的10X内切酶缓冲液(若同时使用两种不同 的酶，为了直接进行克隆，若可能的话用一种适合于两种酶的缓冲液，这些限制因素 在设计添加位点时就必须考虑)。加入5-10单位的内切酶，用蒸馏水补到100μl。
2.在合适的温度下酶解2-3小时。
3.如果内切酶是热不稳定的，用70℃加热使酶变性失活，若是热稳定的，用等体 积的缓冲液饱和酚来抽提。
制备要连接的限制性酶切DNA
PCR产物中的dNTPs可以抑制连接反应，而且连接前DNA也需进行浓缩，用醋酸 胺、异丙醇来纯化DNA或用“Glassmilk”来吸附及洗脱纯化。
在10μl反应体系中，加入25%已纯化的DNA，和200ng酶切载体DNA进行连接。
连接后，用酚抽提，乙醇沉淀有时可以提高转化效率。
操作指南B:用PCR进行特异性的突变和重组
