图二.位点特异性突变和利用序列重叠来组合PCR片段。箭头表示靠近于它们在靶 DNA序列退火位点上的寡核苷酸引物。两个中间或叫内侧引物与靶序列有一个碱基错 配，它们退火到靶DNA链的同一部位，但引发合成的方向相反。错配导致了在两个初 级PCR产物中发生同样的序列变异。PCR1和PCR2是分别进行的，产物从过量的引物中 分离出来，然后混合，变性再退火。有些分子如图所示通过中间引物的重叠而重组。 带有内陷3'-末端的DNA链的重组体的延伸将产生一个可以用原来的外侧PCR引物扩增 的分子，这两个引物可调出在远离其末端有一个特异性碱基变异的DNA分子。
图三.由PCR产生插入、缺失和序列重组。A:互补的两个引物，可以用将一小段插 入序列带入两个重叠PCR片段的末端。(插入子由环状表示，注意:如图所示:插入序列 不一定于引物的5'-末端。)如图二所示:可通过组合两个重叠的PCR片段，将插入子序 列可通过PCR合成一完整插入片段，将其与两侧的PCR片段连接，如(C)所示。B:通过 重组重叠PCR产物，重叠引物可使靶基因上的一段序列丢失。C:重组PCR法，毫不相关 的PCR片段，可以通过在5'-添加互补重叠序列而重组在一起。重叠PCR片段的组合如 图二所示。
这些过程详见图二、图三。图二显示了以错配的形式在引物和靶序列之间引入一 个特异性的替换碱基。通过使用重叠PCR，这个替换的碱基就被移到DNA片段的中央。 图三A显示了将一个小插入片段作为添加序列加到引物上。在这个方案中，插入子的 大小受到引物长度的限制。不过要获笪长的插入片段，可先把完整插入序列做成一个 PCR产物，然后通过重叠引物使之与边侧序列组成。图三B图示了可用来产生缺失的重 叠引物。图三C表明重叠添加序列是如何将一个假定的启动子结合到基因序列上的。 将不同的序列组装丐来的PCR技术称为“重组PCR”，该方法详见操作指南B。
有报道用这种PCR方法可将替换位置于300-800bp的PCR片段的中间部分。Vallette 等也报道了用添加序列的方法来获得插入和缺失。Horton等准确地将四个不同序列重 组最终产生一个970个碱基的DNA片段，该片段编码镶嵌型小鼠第一类MHC蛋白。Hortor 称这种方法为SOE，或重叠延伸拼接法(Splicing by Overlap extension)。
PCR反应中的无用突变
若PCR产物是用在集合(aggregate)反应中，那么在扩增过程中产生的低水平、随 机的突变并不影响最终结果，因为绝大多数分子在任意位点上的核苷酸都是正确的。 然而，若PCR产物是用来克隆的，例如克隆入表达载体，那么克隆在载体中的分子若 在序列上发生不需要的变异将影响最终结果。这是用PCR方法与重组DNA方法相比最为 严重的弊端。
在一个逆向反应中，已经分析出Taq DNA聚合酶每9.000个核苷酸中就存在一个错 误掺入的核苷酸，每41.000个核苷酸中就将发生一个移码突变。预料，PCR反应经过 20次复制倍增(Doubling)后，将使DNA分子随机突变为900个碱基发生一次。然而，在 PCR条件下的错误掺入，并不一定总是在最终产物中产生序列差异。虽然Taq聚合酶没 有3'到5'的外切酶校正功能，使得错误掺入的碱基不能被除去，但它可使延伸的DNA 链终止。在这种情况下，这些错误将不会在随后的PCR循环中蔓延。
对已经克隆的来自同一扩增出反应的PCR产物，测序结果表明序列突变频率较 大。一项研究比较了PCR扩增出的HLA基因序列的克隆，发现在大约25个倍增复制后， 平均400个碱基中就有一个发生错误掺入。然而，Goodenow等21检查PCR扩增的HIV序 列的克隆子，发现克隆子之间的序列差异至少比同样数目倍增复制产物少10倍。HoT Horton等人采用限制循环次数也对这种物异性突变进行研究，分别发现:在3900个碱 基的序列中有一个无用的突变，及在1800个碱基的序列中有一个。这个比率还是可以 接受的。造成这些变异的原因目前尚不清楚。复制倍增次数、扩增的条件以及需扩增 的序列长度等可能影响无用突变频率。
从目前情况看，进行反应的dNTP浓度最好在50-200mmol之间(太高的浓度将产生 错误掺入)，引物的退火温度应尽可能地高(这样错误掺入就更可能导臻链的终止)， 滞留在高温下的总反应时间也应尽可能地短，以防止DNA被降解而产生更多的错误掺 入，因而要使用最少的PCR循环。在使用PECI热循环系统时，变性温度一般为30秒就 足够了。对于小于1kb的片段，引物退火和链延伸的时间最多为30秒。
