（二）细菌的收获和裂解
1．收获
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
2）按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
2，碱裂解法
1）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
2）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。
3）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）
1％SDS
盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
4）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾
60ml 冰乙酸
11.5ml 水
28.5ml 所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物。
5）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4）]。
6）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。
7）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
8）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
9）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
四、质粒DNA的纯化
聚乙二醇沉淀法质粒DNA
氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA
（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1）将核酸溶液所得]转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。
3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。
5）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。
6）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。
7）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。
8）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE（pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。
10）纯化。
