5 ．愈伤组织分化及生根培养：愈伤组织转入附加卡那霉素的固体分化培养基中诱导分化，将分化出的幼苗转入附加卡那霉素的生根培养基中培养。
说明：共培养时不要振荡，培养条件必须有利于细胞旺盛分裂，才能得到较好效果。
（五）原生质体与农杆菌共培养转化
目的：以原生质体为受体细胞，进行农杆菌介导的目的基因转化。
材料：烟草，带目的基因的根癌农杆菌。
试剂 ：
（1）原生质体分离缓冲液：0.07 % MES [ 2 , ( N－吗琳)－乙基磺酸] ，0.07 % CaC12 , 0.11%
NaH2PO4 , 0.5mol/L 甘露醇（pH5.8）。
（2）原生质体分离酶液：l%～2%Cellμlase onozuka R－10（纤维素酶R－10) , 0.1% Macerozyme
R10（果胶酶R10)，溶于原生质体分离缓冲液（pH5.8）。
（3）16 ％蔗糖溶液。
操作：
1．烟草叶肉原生质体制备：
(1) 以12 周龄烟草植株为试材，选取已伸展开的幼嫩叶片按下面程序进行表面消毒：①浸于70％乙醇30 秒，无菌水冲洗1 次。②浸入5％次氯酸钠溶液（其中可加入少许Tween20) 30 分钟，无菌水冲洗3 遍。③浸入1％次氯酸钠溶液10 分钟，无菌水冲洗3 次。
(2) 无菌操作剪碎叶片，放入培养皿中，加入25mL 左右的原生质体分离酶液，于28℃、20～30min 轻摇4～6 小时。
(3) 用倒置显微镜观察原生质体分离情况。
(4) 将分离良好的原生质体悬液，用60～8μm 孔径的滤网过滤，原生质体进入滤液。
(5) 滤液经600r/min 离心5 分钟，原生质体沉于管底，除去上清酶液。
(6) 离心管内加入2mL 原生质体分离缓冲液重悬沉淀，然后在管底缓缓加人16％蔗糖溶液800r/min 离心10 分钟，原生质体漂浮在蔗糖溶液与分离缓冲液中间界面上。
（7）吸取原生质体，用分离缓冲液洗涤，600r/min 离心3 分钟，去上清液。
（8）反复洗涤2～3 次后供转化使用。
２．原生质体预培养：
(1) 用含0.4mol/L 蔗糖的K3 + NAA0.1 + KT0.2 的液体培养基重悬原生质体，使终浓度为1～2×105/mL。
(2) 将原生质体液体培养基悬液分装于9cm 的培养皿中，每皿5mL 左右，在弱光照（400 lx）下培养至原生质体第一次分裂前。
3. 农杆菌培养：
(1) 将农杆菌接种于YEB 液体培养基中，在27℃、200r/min 条件下振荡培养至OD600为0.5 左右。
(2) 将菌液转入无菌离心管中，5000 r/min 离心5 分钟收集菌体。
(3) 用原生质体液体培养基悬浮、稀释至细胞浓度为1×109 放置冰上待用。
农杆菌培养的另一种做法是经步骤(1)后，取lmL 菌液加入到50～100mL 新鲜的YEB ( pH7.0)或原生质体培养液（pH5.8）中，同时添加入AS100μmol/ L，继续培养至OD600 为0.2 左右时即可直接使用。
4 ．共培养：取5μl 农杆菌加入到盛有原生质体的培养皿中轻轻地混匀，使农杆菌：原生质体约为100 : 1 ，农杆菌终浓度约为107 个细胞／mL 。于室温下共培养2 天。
5 ．脱菌培养：将共培养液转入无菌离心管中，700r/min 离心5 分钟，弃上清。用原生质体培养基轻轻悬浮，再次离心，用含有500ug/mL 的羧苄青霉素的原生质体再生液体培养基悬浮，使细胞浓度约为3～6×104，于室温脱菌培养并诱导分裂。原生质体细胞分裂至10 个细胞期时，逐渐降低培养基中的渗透压至原始培养基的一半。
6 ．选择培养：离心收集小细胞团及微小的愈伤组织，转至含有100～200ug/mL 卡那霉素和
500ug/mL 的羧苄青霉素的诱导愈伤组织或芽再生选择培养基上，进一步培养。
说明：
(1) 原生质体与农杆菌共培养转化具有如下优点：① 转化体来自单个细胞，便于对转化体进行T-DNA 整合及表达的分析，对转化体的分子生物学研究具有重要价值。② 转化频率一般在0.1％～1％，条件适宜时可高达20％。③ 一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。
(2) 原生质体的预培养是实验的一个关键。游离的原生质体在适宜的条件下形成细胞壁，然后进行分裂。将分裂之前刚形成新壁的细胞与农杆菌共培养，就能够成功地转化，在形成新壁之前及经多天培养之后都不易被转化。这很可能是因为转化与原生质体新壁的成分有关。对于不同的植物材料，需进行预备实验，摸索原生质体至细胞第一次分裂前所需的时间，烟草需1～2 天。
