（三）CpTI 基因叶盘法转化甘蓝
材料：
（1）农杆菌LBA4404 ( pRCL27 ）。
（2）甘蓝种子。
操作：
1 ．受体材料准备：甘蓝种子用水漂洗，70 ％乙醇消毒1 分钟，0.1 ％的升汞消毒20～30 分钟，无菌水冲洗5 遍。播种于无菌0.7％固体琼脂培养基上，阳光下培养6～7 天。
2 ．配制培养基
预培养培养基：MS + IAA0.2 + BA2.0
共培养培养基：同上
脱菌培养基：MS + IAA0.2+ BA2.0＋Cef 500mg / L
筛选培养基：MS+ IAA0.2+ BA2.0+ Cef 500mg / L 十Km 25mg / L
生根培养基：1 / 2 MS + IBA 0.5 十Km 25mg / L
抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至50 ℃左右的培养基中，用力摇匀（可将磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅匀）后分装于无菌培养皿中，生根培养基分装于三角瓶中。
3．农杆菌培养
（1）挑取单菌落，接种于20mL YEB + Km 25mg / L + Rif 50mg / L 液体培养基中，27℃、180r/min培养过夜。
（2）取400μl 菌液转接入20mL 无抗生素的YEB 液体培养中，继续培养4～6 小时。
（3）在超净工作台上，将菌液倒入无菌带盖离心管内，盖上管盖，用石蜡膜封口，4000r/min离心5 分钟。
（4）取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS 液体培养基稀释至OD600≈0.2 。
4 ．叶盘法转化
（1）取培养6～7 天的甘蓝无菌幼苗，将胚轴剪成5～8mm 长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25℃，光照条件下预培养2 天。
（2）将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。
（3）向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃2～3 下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤纸上吸去多余菌液。
（4）将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，盖上培养皿盖，用石蜡膜封口，于27℃，黑暗中共培养2 天。
（5）将材料转入到脱菌培养基中，于26℃ ，光照条件下培养6～7 天。
（6）将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。2～3 周有绿芽分化。
（7）将绿芽转入筛选培养基，2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养3～4 代，淘汰白化的及畸型苗
（8）选择形态正常，生长旺盛的抗性绿苗，转入生根培养基中，15 天后可见幼根生成。待根系形成后取出小苗，自来水洗净根上的琼脂，移入珍珠岩与草炭土1 ：1 混合的基质中，于温室中培养。
（9）取生长良好的植株叶片提取DNA ，进行PCR 扩增及Southern 杂交鉴定。
说明：LBA4404 (pRCL27）为双元载体，所含pRCL27 质粒的T－DNA 中有NPT 一l 基因和以CaMV35S 启动子调控的CpTI 基因。由中科院遗传所朱祯实验室构建。
（四）悬浮细胞与农杆菌共培养转化
目的：以悬浮培养的单细胞或细胞团为受体，与农杆菌共培养实现目的基因转化，并通过再生获得转基因植株。
材料：
（1）烟草愈伤组织。
（2）含NPT-Ⅱ基因质粒载体的农杆菌菌株。
（3）悬浮培养液：愈伤组织培养基成分中增加2,4－D 浓度，可至2mg/L；VB1、VB6 浓度可增至10mg/L；烟酸浓度可增至5mg/L，并加入水解酪蛋白1g/L。
操作：
1. 悬浮细胞系的建立
(1) 在150mL 的三角瓶中加入约50mL 的悬浮培养液。
(2) 取生长快，松散的愈伤组织转入悬浮培养液中，24℃、100r/min 振荡培养。
(3) 每隔3 天转入新培养液中继代一次。
2. 农杆菌培养
（1）将农杆菌接种在YEB 液体培养基中，于28℃、200 r/min 振荡培养至OD600 为0.6～0.8。
（2）取20mL 菌液置无菌离心管中，4000r/min 离心5 分钟，收集菌体。
（3）用细胞悬浮培养液重悬菌体，并稀释至OD6000.25 左右，置冰上待用。
（4）另一种做法是取lmL 菌液加入到50～100mL 新鲜的YEB ( pH7.0）或细胞悬浮培养液中
（pH5.8) ，同时加入l000mol/LAS 继续培养至OD6000.25 左右，约4～6 小时，放置冰上待用。
3 ．共培养转化
（1）将农杆菌液置20℃平衡几分钟。
（2）取4mL 处于对数生长期的植物细胞悬浮液放入直径为10cm 的培养皿中。
（3）再加入4mL 平衡好的农杆菌液混匀，于28℃静止培养2 天。
4 ．转化体筛选
（1）将共培养物低速离心（700r/min ) ，弃上清。
（2）加入细胞悬浮培养液洗涤细胞沉淀3 次。
（3）最后用含500ug/mL 羧苄青霉素或头孢霉素及100 ug/mL 卡那霉素的选择细胞悬浮培养液重悬细胞沉淀，于24℃100r/min 条件下进行选择培养。
（4）当出现微小愈伤组织后转入固体选择培养基上进行愈伤组织继代选择培养。
