一、实验目的
1.学习辣根过氧化物酶的制备方法。
2.掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法。
二、实验原理
过氧化物酶催化以下反应：
2 H₂O₂ ─→ O₂＋2H₂O
这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，简称HRP，EC 1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。随着酶标技术的发展，作为标记酶，辣根过氧化物酶的是目前使用最普遍的一种酶，它的标记物既能用于定位检测，也能用于定量测定，因此分离制备辣根过氧化物酶很有实际意义。
本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冷冻干燥，最后制得高纯度的辣根过氧化物酶。
辣根过氧化物酶分子量在40，000左右，是一种含亚铁血红素的蛋白质，等电点7.2；易溶于水，溶解度为5％(W/V)，溶液呈棕红色，透明；也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH为7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下HRP在几周内保持稳定，加热到63℃后15分钟内稳定。
辣根过氧化物酶氧化还原电势很低，pH6.08时，E’0＝ -0.2070v；pH为7.71时，E’0＝ -0.5787v。
辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步：
第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ


第二步，复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ：
复合物Ⅰ＋AH──→复合物Ⅱ＋A      (2)
第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶：

AH：表示还原型氢供体。
在一定程度上复合物II可自发地分解成HRP和产物(P)，亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ。

辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种，主要原理介绍如下：
1、Rz值，提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度。

403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓度为1毫克蛋白／毫升。
2、愈创木酚法：测k4［见反应式(3)］。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应如下：

四邻甲氧基连酚

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