四、操作步骤
(一)测定过氧化物酶
1.酶液的制备
取5.0g 洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放人研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g 离心10min，上清液转入25mL 容量瓶中。沉淀用5mL 磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。
2. 过氧化物酶活性测定
酶活性测定的反应体系包括：2.9mL0.05mol/L 磷酸缓冲液；1.0mL2％H₂O₂；1.0 mL0.05mol/L 愈创木酚和0.1mL 酶液。用加热煮沸5min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0mL 20％三氯乙酸终止反应．然后，过滤，适当稀释，470nm 波长下测定吸光度。
以每分钟内A₄₇₀，变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。
(二)过氧化氢酶活性的测定
1. 酶液提取用小麦叶片2.5g 加入pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r/min 离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2. 取50mL 三角瓶4个(两个测定，另两个为对照)，测定瓶加入酶液2.5mL，对照加失活酶液2.5mL，再加入2.5mL 0.1mol/LH₂O₂，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10％H₂SO₄ 2.5mL。
3. 用0.1mol/LKMn04标准溶液滴定，至出现粉红色(在30min 内不消失)为终点。酶活性用每克重样品lmin 内分解H₂O₂的毫克数表示。
五.计算

A₄₇₀—为反应时间内吸光度的变化；
W—为马铃薯鲜重(g)；
t—为反应时间(min)；
V_T—为提取酶液总体积(mL)；
V_s—为测定时取用酶液体积(mL)。

A—为对照KMnO4滴定毫升数；
B—为酶反应后KMn04滴定毫升数；
V_T—提取酶液总量，mL；
V_s—为反应时所用酶液量，mL；
W—为样品鲜重，g；
T—为反应时间，min；
l.7—为1mL 0.1mol/LKMnO₄，相当于1.7mgH₂O₂。
注：所用KMn04溶液及H₂O₂溶液临用前要经过重新标定。

上一页  [1] [2]