(二)样品的处理
(1)固体样品 随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h，用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥1h，称重一次，恒0重即可。
(2)血清样品 取人血(或猪血)放入离心管中，与冰箱中放置过夜。次日离心除去血凝块，上层透明清液，即为血清。吸出1mL 血清加到50mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。溶液如果显混浊，加少量氯化钠再混匀。
(3)卵清蛋白 取2g 卵清蛋白溶于0.9%NaCl 溶液并稀释至100mL。如有不溶物，离心取上清液备用。
(三)消化
取5支消化管并编号，在1、2、3号管中各加入精确称取干燥样品(注意：加样品时应直接送入管底，避免沾到管口和管颈上)，加催化剂0.5g，混和消化液3mL，在4、5号管中各加相同量的催化剂和混合消化液(若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水)作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。摇匀后，将5支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到消化管的颈部，否则将严重地影响样品测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时，适当加强火力。在消化时，应是全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将消化倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。通常消化需要1～3h(对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间)。待消化液变成褐色后，为了加速消化完成，可将消化管取出，稍冷，加30%过氧化氢溶液1～2滴于管底消化液中，再继续加热0.5h。消化完毕，取出消化管冷却至室温。
(四)蒸馏
(1)仪器的洗涤 仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器(正在测定中的仪器)加样前使蒸汽通过1～2min 即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸气洗涤到吸收蒸汽的硼酸—指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。洗涤方法如下：
取2～3个100mL 锥形瓶，加入10mL 2%硼酸、2滴混合指示剂，用表面皿覆盖备用。现煮沸蒸汽发生器，其中盛有2/3体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。这样用蒸汽洗涤5min 左右，在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸—指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部已洗涤干净。下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1min。最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口，排废开始。用右手轻提样品杯中棒状玻塞，
使水流入反应室的同时，立即用左手关闭夹子，盖好玻塞。由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中，再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，如此反复三次既可排尽废液及洗涤液。打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出，关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪1~3min，可进行下一次蒸馏。
(2)样品及空白的蒸馏 取5个100mL 锥形瓶，分别加入2%硼酸10mL，混合指示剂2滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。
把消化管中的消化液全部转移到样品杯中，用约2mL 蒸馏水冲洗消化管，重复3次，把洗涤液都倒入样品杯中，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量蒸馏水冲洗样品杯后也使之流入反应室，盖上玻塞，并在样品杯中加约2/3体积的蒸馏水进行水封。而后将装有硼酸—指示剂的锥形瓶放在冷凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放10mL40%氢氧化钠溶液于反应室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸—指示剂混合液由紫红色变为绿色，自变色时开始计时，蒸馏3～5min。移动锥形瓶，使硼酸液面离开约1cm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，继续蒸馏1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端尖嘴，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。排液和洗涤等操作与前面相同。排废洗涤后，可进行下一个样品的蒸馏(每一个样品要同时做三份，以求得准确结果)。待样品和空白消化液蒸馏完毕后，同时进行滴定。
(五)滴定
全部蒸馏完毕后，用0.001mol/L 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡葡萄紫色，即为滴定终点，记录所耗HCl 溶液量。
五、计算
样品的总氮含量(%)=(A—B)×0.001×14.008×100/1000×C
若测定的样品含氮部分只是蛋白质(如血清)，则：
样品中的蛋白质含量(%)=(A－B)×0.001×14×6.25×100/1000×C
A－滴定样品用去的盐酸体积(mL)；
B－滴定空白用去的盐酸体积(mL)；
C－称量样品的量(g)；
0.001－盐酸的摩尔浓度(mol/L)；
14－氮原子量；
6.25－系数(1mL0.001mol/L 盐酸相当于0.14mg 氮)。
若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮－非蛋白氮
粗蛋白质含量(%)=蛋白氮×6.25
