(三)蛋白质的两性反应和等电点测定
仪器
试管和试管架、滴管、吸量管(1和5mL)。
试剂
1. 0.5%酪蛋白溶液(以0.01mol/L 氢氧化钠溶液作溶剂)
2. 酪蛋白醋酸钠溶液 称取纯酪蛋白0.25g，加蒸馏水20mL 及1.00mol/L 氢氧化钠溶液5mL(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00mol/L 醋酸5mL(必须准确)，倒入50mL 容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果酪蛋白溶于0.10mol/L 醋酸钠溶液内，其浓度为0.5%。
3. 0.001%溴甲酚绿指示剂
4. 0.02mol/L 盐酸溶液
5. 0.10mol/L 醋酸溶液
6. 0.02mol/L 氢氧化钠溶液
7. 0.01mol/L 醋酸溶液
四、操作方法
(一)蛋白质的沉淀反应
1.盐析作用：取1支试管加入3mL 蛋白质氯化钠溶液和3mL 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
2.乙醇沉淀蛋白质：取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL 混匀。观察有无沉淀析出。
3.有机酸沉淀蛋白质：取2支试管，各加入蛋白质溶液约0.5mL，然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5%磺基水杨酸数滴。观察蛋白质沉淀。
4.重金属盐沉淀蛋白质取：2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。
5.生物碱试剂沉淀蛋白质取：2支试管，各加蛋白溶液2mL 及1%醋酸4～5滴。其中一管滴加5%鞣酸，另一管滴加饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。
(二)蛋白质的颜色反应
1.双缩脲反应
①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有无紫色出现。
②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
注意事项：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用
生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察。
2.蛋白质的黄色反应
在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液5滴，观察颜色反应。
3.米伦氏反应
① 用苯酚做实验：取0.5%苯酚溶液1mL 于试管中，加米伦试剂约0.5mL(米伦试剂含有硝酸，如加入量过多，能使蛋白质呈黄色，加入量不超过试液体积的1/5～1/4)，小心加热，溶液即出现玫瑰红色。
② 用蛋白质溶液做实验：取2mL 蛋白质溶液，加0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故)，小心加热，凝固之蛋白质出现红色。
注意事项：蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，如此试剂不能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有H2O2、醇或碱，因它们能使试剂中的汞变成氧化汞沉淀。遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和。
4.茚三酮反应
取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意：此反应必须在pH5～7进行)。
(三)蛋白质的两性反应操作方法
1.取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.01%溴甲酚绿指示剂5～7滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。
2.用细滴管缓慢加入0.02mol/L 盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH 接近于酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。
3.继续滴入0.02mol/L 盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明其原因。
4.再滴入0.02mol/L 氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。继续加入0.02mol/L氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化，说明了什么问题？
(四)酪蛋白等电点的测定
1.取9支粗细相近的干燥试管，编好号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。
2.加完后观察上述各管的混浊程度，静置约20min，再视其沉淀情况，以-，+，++，+++，++++
符号表示沉淀的多少。根据观察的结果，指出哪一个pH 是酪蛋白的等电点(混浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的pH 值，即为酪蛋白的等电点)。
3.该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应该严格按照定量分析的操作进行。为了保证实验的重复性或为了进行大批量的测定，可以事先按照上述的比例配制成大量的9种不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确吸取4mL 该溶液，再各加入1mL 酪蛋白醋酸钠溶液。
